一种基于激光全息共聚焦显微镜测量透明液体三维温度的应用

一种基于激光全息共聚焦扫描显微镜测量透明液体三维温度的应用PeterB.Jacquemin*，RodneyA.Herring1(UniversityofVictoria,DepartmentofMechanicalEngineering,3800FinnertyRoad,BC,CanadaV8P5C2）摘要：激光全息共聚焦扫描（CSLH）显微镜是利用一束聚焦激光束测量流体温度在三维空间的分布情况。激光束通过样品并被参考光束干涉形成全息图。折射率的变化将引起全息图边缘移位。边缘移位取决于材料的温度、压力或者成分。层析重建算法是为了显微镜而派生出的基于光束的数值孔径的算法。窄视角扫描受限于激光探测样品的数值孔径和锥角大小，这些因素会增加样品三维数据的误差。显微镜的全息术摄影保留了全息图中基于ak/10波边缘的0.1C敏感温度下对象的相位。通过实验数据得到在三维重建中的温度分辨率在1C。激光全息概念和层析重建全息图数据的方法可以被应用于测量精密的位移、温度、压力以及构成激光波长附近位置的分辨率。微流体和其他领域的研究和应用技术将会考虑到激光全息共聚焦扫描的这种独特的测量特点。关键词：共聚焦；显微镜；全息图；激光；三维重构1.介绍赫林[1]在1997年首次公开发布了结合共聚焦显微镜和全息术概念得到的一个3D显微镜图像。相比只对振幅和光强度敏感的光学显微镜而言，全息显微镜可以记录下研究对象的振幅和相位甚至于光线的全部信息。标准光学显微镜下的样本会吸收光谱能量，这会忽视相位性能和对折射率的敏感程度。激光全息共聚焦扫描显微镜的全息图是利用激光传输通过标本产生的折射率累积效应的测量方式。相移是全息图边缘移位表现出的，全息图的边缘移位是由于折射率的改变的。折射率是由介质或者样本中的光波长以及透过样本的广成长度决定的。激光全息共聚焦扫描显微镜的公交特点降低了图像的像差，同时利用迪克逊[2]等人研发的特殊光学几何结构提高三维扫描图像的分辨率。激光全息共聚焦扫描显微镜的全息技术提供了一种利用相位测量样品折射率的方法。样品的相位通过折射率值的推算就可以推导出基于光学特性的流体的温度。激光焦点在样品中的点扩散函数为170lm，这是通过Zemax光学系统的设计软件和实验测量出的。当扫描的计算网格增加625lm/步，在三维环境下（立体像素大小），每625lm的计算网格内都能产生独立的分辨率。然后再结合多组扫描全息图就可以重建样品的三维折射率。利用激光与样品相互作用的测量结果表现为传感器或全息图中的厚度累积效应。通过样本长度的累计折射率通常被称为层析重建中的氡线积分。侯赛因和沙克赫尔[3]在这个试验中已经利用激光扫描到了样本中的三维图形。侯赛因和沙克赫尔[3]解释了相位解缠但只能得到透过样本厚度的平均温度。Tieng和Chen[4]应用了一种改进后的联立代数方程重建技术对空气流动进行三维重建，但是基于几何构型的敏感性存在误差。激光全息共聚焦扫描显微镜限制了激光探针探测样本时的扫描角度的数值孔径，这样会导致重建矩阵和矩阵的奇异性出现差错。激光全息共聚焦扫描显微镜的挑战在于在一个受限制的扫描视角中产生较低的重建误差。高分辨率的全息图是利用8184像素的CCD线扫描相机记录下的。激光全息共聚焦扫描显微镜的一个独特的特性是样品的完整3D折射率可以从没有任何旋转扫描的单一视角或者观测窗口中得到。扫描光束穿过样品只采用探针重建的数值孔径。3D成像的两个要求即是激光全息共聚焦扫描显微镜成像的需求。样品相对于射线必须是透明的，同时扫描探针必须是一个汇聚光束而不是一个平面光。不同之处在于汇聚光束透过样品作为焦点的是扫描沿着光束的传播轴，而平面光不能区分透过样品路径的任何焦点。每一次扫描都会给出全息图测量的累计厚度折射率。这需要一个由雅克曼和赫林[5,6]提出的名为“威利”的独特的重构方法，从而将厚度扫描全息图转化一种基于激光全息共聚焦扫描显微镜测量透明液体三维温度的应用1为3D模式。3D模式指出了样品某一点的相位和强度。“威利”算法利用所有的相位测量和已知的边界条件计算样品每一点的折射率。另一种基于断层扫描三维重建的方法也是为激光全息共聚焦扫描显微镜而开发，这种方法是为了显示样品的几何信息从而被莱[7]等人提出。“威利”算法的优点在于不需要提前验证样品信息。共聚焦光学扫描全息术的更详尽的研究由雅克曼[8,9]等人实施。一种简单的生成全息图的方法如图1所示，将物体光束和参考光束并排连接，构成的夹角使得重叠的部分和其他部分在相机中生成全息图。这种光学布局需要在扫描时移动样品，同时激光全息共聚焦扫描显微镜利用电流计光束控制反射镜从外侧转化为样品的激光探针焦点。图1参考光束与物光束在图像平面叠加形成全息图1.1.与其他全息显微镜的相似和异同激光全息共聚焦扫描显微镜是类似于相位成像显微镜，它对透明样本的相移很敏感，这通常是由于温度梯度变化或者是成分变化引起的。一种特殊的区别是温度的测量是通过光线传播的轴向还是样本的深度。对于层析重建，通过限制视角改变数值孔径或者光纤锥角将产生奇异矩阵或者过度重建误差，这是由于重建矩阵的缺陷引起的。共聚焦显微镜通常采用针孔透过一个狭窄的荧光样品的光谱带。散焦射线受阻将减弱聚焦深度。共聚焦显微镜逐点扫描样品，并且通过样品深度的多平面叠加重构一个图形。多平面叠加后的合成图像接近无限的景深。区别在于激光全息共聚焦扫描显微镜使用共焦光学减少了对全息图的光学畸变以及扫描镜倾斜式与参考光束产生的偏离轴线误差。锥角三维重建方法需要至少160°的扫描角度，激光全息共聚焦扫描的锥角扫描时使用二十八条探测光束。充电误差是通过包括沿着侧壁的边界温度条件建立，这种方法用于显微镜的特点。描绘几何体，利用在整个样本上分布的边缘射线束以及边界条件的稀疏成都来进行重建矩阵的反演和三维重建。1.2.限制和性能激光全息共聚焦扫描显微镜可以通过阻断参考光束从而很容易地被成像显微镜控制，这对于检测不透明生物样本很有好处，同时可以提供全息模式中透明区域结构的敏感性。激光全息共聚焦扫描显微镜类似于数字全息显微镜或者相位成像显微镜，但是它不能生成一个图像，而是将全息图转换为温度或者是温度的组合图。探针光束的数值孔径可以相对地提高重建的精确度，这将在样本上产生更大尺寸的焦斑同时减少光学分辨率。一种折衷于高光学分辨率和低重建误差的设计达到了0.32的数值孔径以及一个模糊光斑直径为220lm的探测光束。位置分辨率采用光束控制镜是0.1mat和625lm的扫描步距。一个k/20波的可溶解的边缘变化可以引起的温度误差是0.02°C，这代表了样品试管5毫米深度时的平均温度变化。温度稳定性由电池中的加热器的功率、三重绝缘热电偶的冷节点决定，全息图的稳定性由高压电流阻尼的光学仪器的主动隔振控制。相移的限制在相位扫描中不能超过一个波长，否则波长或者周期的数值是不确定的，相位解缠也是不能实现的。这限制了槽内温度6度以内的变化。添加一个不同波长的激光可以将温度区间扩大到50摄氏度，同时由于相位解缠能力会保持稳定的温度分辨率。一种基于激光全息共聚焦扫描显微镜测量透明液体三维温度的应用22.激光全息共聚焦扫描显微镜的设计和实验步骤激光全息共聚焦扫描显微镜采用光束转向镜和转化模块扫描一个如图2所示的固定液态样品。激光全息共聚焦扫描光学设计的一个关键环节是在扫描时，针孔光阑在共焦光学截面要保持静止。共焦光学减少了光学像差，比如彗形象差和虚拟光圈，这在样品中都是重要的光学共轭焦点。在扫描期间，全息图的光学畸变减少是因为只有样本射线透过焦点和针孔光阑才能产生全息图。激光全息共聚焦扫描显微镜的光学设计如图2所示，示意图展示了一束直径可从35nm扩展到456nm的蓝色激光，然后波阵面被分为两个间距为6mm的D形波束。光线进入到光束转向镜(BSM)部分，得到了样本中由间隙提供的±2.5mm的x轴和y轴扫描结果。光线从BSM部分传出进入到一个光学循环，它在样本放置处包含一个远心镜头。一个在光学循环中继透镜中的潜望镜改变了光线的传播方向，并且在立方分束器上建立了一个光平面。图2CLSH显微镜的光学设计通过待测样本的光束为物光束，绕过待测样本的光束是参考光束。参考光束透过液体样本，恒定的折射率产生了相同的焦点，物体光束也将再准直。全息图将显示每一个扫描位置，除了激光全息共聚焦扫描显微镜产生的光学相移没有光路穿过的位置。这些光学畸变对测量产生的影响，将会记录在全息图的每一个扫描位置上。然后采用流体样本测量来消去光学影响。图3CSLH显微镜的内部结构远心镜头系统安装在传输轨道上，并且沿着光学传播轴向即Z轴扫描方向。这个装置为扫描提供了一个固定的样本，这样可以明显的减轻震动。降低样本的震动干扰对于敏感性的科学研究是非常重要的，比如这些干扰会产生微重力的影响。液态样本中的聚焦光束被设定为f/4焦比或者28度的收敛角，这样可以降低重建误差（见第4节）。光线在同一立方分光镜出离开光学回路，它们进入并方向传播到BSM部分。随后光线被分离到共聚焦光学部分，它们通过一个共焦双针孔焦点到达液体样品的物体光束位置。双针孔孔径定义了一个共轭光学配置样本内的焦点，消除了过度的球面像差以及光束扩展器、BSM部分、光学循环不愤和潜望镜头产生的彗形像差。然后光线通过另一个远心镜头进行二次瞄准，然后射入到双光楔或菲涅耳双棱镜。被光楔或双棱镜偏转后的光束干涉到CCD相机。通过BSM部分的你想光束传播提供了样品光束的固定焦点，同时参考光束在扫描时进入到双针孔孔一种基于激光全息共聚焦扫描显微镜测量透明液体三维温度的应用3径中。进一步的细节雅克曼[5]在其他光学研究中提出。图3显示了一个安装在光学平台上的激光全息共聚焦扫描显微镜。图示免回的是一个用于这些实验的457nm的蓝色激光，一个658nm的红色激光（没有在这些实验中用到）以及一些光学组件如反射镜、镜头。光学棱镜和千分尺。这种显微镜包含一个新港XPS-C8运动控制器、新港气动隔震以及剑桥工艺的BSMs电流计。传输段有一个0.1lm的位置分辨率，并且被一个虚拟仪器程序控制。图4中显示的是一个包含均BK7玻璃溶液的试管在底部3毫米以上的部位加热。试管底部的加热器给液体样品提供了一种基于径向扩散的温度梯度。用一根热电偶探针测量边缘温度和内部温度实现整个计算网格的重建方法。图4热电偶与底部加热器抛光石英玻璃是一个内部规格为5×5×45立方毫米的透明容器。它被装满了Carg实验室与BK7液体电池相匹配的硅油。硅油的折射率是一个和波长与温度相关的函数，它的折射率在波长为457nm以及温度为25摄氏度的条件下为1.4670。和波长相关的折射率是由柯西方程得到，并由Cargille实验室BK7规格的匹配液提供。折射率(n)转换为温度(T)是基于折射率硅油的特性，有以下方程给出：43.65101/CdndT(1)温度的范围在15到35摄氏度。温度范围被控制在小于7摄氏度是为了在测量液体样本点时避免相移大于单个边缘的间距。温度范围大于7摄氏度时需要进行相位解缠。高浓度的硅油减小了对流电流并且提供了加热时所需的导热方式。稳态热传导条件提供了光栅扫描测量显微镜的特点。探针的大小和热电偶可以降低任何对流电流和低温散热器的影响。图5扫描和重建时的坐标系和计算平面如图5所示，沿Y轴的垂直切片提供了三维重建的第三条轴。第一条轴沿着激光传播滤镜或Z轴进入到液体电池中，第二条轴在水平面沿着X轴在也电池的边界极点处传播。垂直切片或水平面沿着Z轴被扫描，如图6所示。光束的扫描焦点在8个恒定的x(i-1)较低的位置，其他的8个焦点在恒定的x(i+1)的较高的位置。通过锥面光束的边缘光线产生的干涉条一种基于激光全息共聚焦扫描显微镜测量透明液体三维温度的应用4纹图样被用于重建算法中。这两束边缘光线与扫描位置结合在水平面或者垂直面产生了2(8+8)=32的相移。边界温度条件是沿着液体电池侧壁所得到的X轴的最大值和最小值。加热器的垂直距离是与高度坐标系相关，如表1表示在恒定的垂直面上有一个0.6mm的距离。折射率分布图转换到温度分布，是由四个垂直平面决定