一种来源于中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因-撰写1122

1说明书摘要一种来源于中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因及其克隆方法，该方法包括步骤：(1)根据Genebank中不同物种的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的保守序列，设计保守区序列引物FAD6-F1(+)/FAD6-R1(-)，以中华绒螯蟹肝胰99999腺总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因片段核心片段，将核心片段克隆到载体上并测序；(2)根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’-和3’-RACE引物，FAD6-5’(-)和FAD6-3’(+)，以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的5’-cDNA和3’-cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段，将得到的该片段分别连接至载体后克隆并测序；(3)将5’和3’末端片段分别与获得的delta6去饱和酶基因核心片段进行拼接得到delta6去饱和酶基因全长序列。摘要附图1权利要求书1.一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种权利要求1所述的中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3.权利要求1所述的中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因的克隆方法，该方法包括以下步骤：(1)根据Genebank中不同物种的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的保守序列，设计保守区序列引物FAD6-F1(+)和FAD6-R1(-)，以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因片段核心片段，将核心片段克隆到载体上并测序，FAD6-F1(+)的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，FAD6-R1(-)的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；(2)根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’-和3’-RACE引物，FAD6-5’(-)和FAD6-3’(+)，以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的5’-cDNA和3’-cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段，将得到的该片段分别连接至载体后克隆并测序，FAD6-5’(-)的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，FAD6-3’(+)的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；(3)将5’和3’末端片段分别与所述核心片段进行拼接得到delta6去饱和酶基因全长序列。4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(1)和(2)中总RNA是从中华绒螯蟹肝胰腺中通过Trizol法提取得到的。5.根据权利要求3所述的方法，步骤(1)和(2)中所述载体是pGEM-T质粒6.一种载体，其包括权利要求1所述的中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因。7.一种转染细胞，其包括权利要求5所述的载体。8.一种转染细胞，其表达权利要求2所述的蛋白。9.根据权利要求7或8所述的转染细胞，其中所述细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或金斯瑞酵母中一种。10.根据权利要求9所述的转染细胞，其中所述转染细胞为大肠杆菌。1说明书一种中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因及其克隆方法技术领域本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因及其克隆方法。背景技术多不饱和脂肪酸(PUFA)是生物膜结构的重要组成部分，同时对人类的健康也具有重要作用，膳食中摄入的PUFA对心律失常有抑制作用，并且PUFA对心血管疾病的辅助治疗和预防也发挥了一定作用。此外，LC-PUFA与人体的健康更加密切相关，如二十二碳六烯酸(DHA)可关系到胎儿的生长，发育，某些LC-PUFA还可以降低炎症、癌症及心脑血管疾病的发病率等。当前常见的多不饱和脂肪酸EPA和DHA的来源主要是深海鱼油，然而随着市场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少，该途径已经远远不能满足需要。此外环境污染等原因致使鱼油中的重金属含量越来越高。因此，寻找更为持续稳定的EPA和DHA来源已经成为当务之急。探索利用转基因技术，例如使转基因的物种成为“绿色工厂”，稳定、高效地生产EPA和DHA是一个重要途径。脂肪酸去饱和酶(Fattyaciddesaturase，FAD)是生物体合成PUFA的关键酶，可催化饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸酰基链上的双键的形成，使脂肪酸不饱和程度得以提高。目前已知的多不饱和脂肪酸合成的过程示于图5中，其中delta6去饱和酶是PUFA合成过程中的限速酶，能够催化饱和脂肪酸的第一步去饱和过程，它催化亚油酸（LA）生成γ-亚油酸（GLA），以及催化α-亚麻酸（ALA）生成十八碳四烯酸（stearidnoicacid），它们是EPA及其后DHA生成的关键酶。目前研究已经从秀丽隐杆线虫、小鼠、斑马鱼、虹鳟、军曹鱼、大西洋鲑鱼、鲈鱼、鲍鱼、金头鲷鱼等中克隆到delta6去饱和酶基因，但是目前有效利用于转基因物种的商业化应用的delta6去饱和酶数量不多，且选择范围小，因此继续克隆并筛选具有较高底物专一性和催化活性的delta6去饱和酶使当前的研究热点之一。中华绒螯蟹由于其肉味鲜美，营养丰富，深受广大群众的喜爱，是目前水产养殖中的经济养殖物种。其肝胰腺中脂肪含量达50%，脂肪对中华绒螯蟹的生长和性腺发育具有重要的作用，其中EPA和DHA等PUFA是中华绒螯蟹等蟹类所必需的脂肪酸，因此探索中华绒螯蟹PUFA合成酶的功能具有较大的现实意义。本发明通过对中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因的克隆、基因的序列分析，对该去饱和酶基因在中华绒螯蟹中的可能作用机制进行了初步探索，为中华绒螯蟹PUFA的合成以及转基因研究开发，例如利用转基因物种生产PUFA所必须的去饱和酶基因，提供了一个基础。2发明内容本发明的目的在于提供一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因。本发明的另一目的是提供一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因编码的蛋白。本发明的另一目的是提供一种中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因的克隆方法。为了实现上述目的可通过以下技术方案实现：(1)根据Genebank中不同物种的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的保守序列，设计保守区序列引物FAD6-F1(+)和FAD6-R1(-)，以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因片段核心片段，将所述核心片段克隆到载体上并测序，FAD6-F1(+)的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，FAD6-R1(-)的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示；(2)根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’和3’RACE引物FAD6-5’(-)和FAD6-3’(+)，以中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的5’-cDNA和3’-cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段，将获得的末端片段分别连接至载体后克隆并测序，FAD6-5’(-)的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，FAD6-3’(+)的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示；(3)将5’和3’末端片段分别与所述核心片段进行拼接得到delta6去饱和酶基因全长序列。在本发明的一个优选实施例中，步骤(1)和(2)中总RNA是从中华绒螯蟹肝胰腺中通过Trizol法提取得到的。在本发明的一个优选实施例中，步骤(1)和(2)中所述载体是pGEM-T质粒。本发明还提供一种载体，其包括中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因。本发明还提供一种转染细胞，其包括上述载体。本发明还提供一种转染细胞，其表达上述蛋白。在本发明的一优选实施例中，该转染细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、金斯瑞酵母等中的一种，优选为大肠杆菌。与现有的去饱和酶基因相比，本发明的基因具有以下特点：本发明得到的中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因cDNA的全长序列包括183bp的5’UTR区域、1326bp的ORF和801bp的3’UTR区域，共编码442个氨基酸，其中3’UTR区域具有典型的加尾信号AATAAA及polyA尾。本发明首次报道从中华绒螯蟹中分离克隆了delta6去饱和酶基因，并且首次通过构建表达载体来验证该基因的功能，并证实了该基因能在大肠杆菌表达系统中稳定表达，且后续蛋白水平上的研究表明，该基因编码的蛋白具有能够将LA和ALA分别转化为γ-亚麻酸和十八碳四烯酸的活性，从而为EPA和DHA等PUFA的合成奠定了底物基础，为进一步研究中华绒螯蟹PUFA的合成提供了一定的依据。delta6去饱和酶基因编码的氨基酸序列包括：三个组氨酸簇保守区、一个细胞色素3b5结构域以及血红素结合域HPGG，delta6去饱和酶基因编码的氨基酸还含有四次跨膜结构域。经过序列比对，发现得到的中华绒螯蟹delta6去饱和酶与NCBI上已报道的中华绒螯蟹、罗非鱼、尖吻鲈、大西洋鲑、虹鳟、菁夜蛾及小鼠等物种的delta6去饱和酶氨基酸相似性在40%-76%内。使用MAGE对上述物种delta6去饱和酶基因相关氨基酸序列构建系统进化树，结果如图3所示。中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因与菁夜蛾聚为一支，其余物种聚为一大支。附图说明：图1显示了中华绒螯蟹的delta6去饱和酶基因的核苷酸序列。图2显示了中华绒螯蟹的delta6去饱和酶的氨基酸序列。图3显示了中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因与其它物种delta6去饱和酶氨基酸序列比对。图4显示了中华绒螯蟹delta6去饱和酶与其它物种FAD6氨基酸序列系统进化树。图5显示了目前已知的多不饱和脂肪酸合成的过程。图6-a显示了未加底物的BL21/pCold-fad6菌株脂肪酸图谱。图6-b显示了空载体BL21/pCold菌株脂肪酸图谱。图6-c显示了加亚油酸的BL21/pCold-fad6菌株脂肪酸图谱，其中1表示亚油酸，2表示γ-亚麻酸)。图6-d显示了加α-亚麻酸的BL21/pCold-fad6菌株脂肪酸图谱，其中1表示α-亚麻酸，2表示十八碳四烯酸。具体实施方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1克隆中华绒螯蟹delta6去饱和酶基因(1)根据Genebank中不同物种的delta6去饱和酶基因进行对比，获得的保守序列，设计保守区序列引物FAD6-F1(+)(其核苷酸序列如SEQIDNO:3)所示和FAD6-R1(-)(其核苷酸序列如SEQIDNO:4)，以Trizol法提取的中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板，进行PCR反应，获得delta6去饱和酶基因核心片段。PCR加样体系为cDNA模板1.0μL，dNTPMixture4.0μL，两种引物(10μM)各0.5μL，10×PCRBuffer(Mg2+Plus)2.5μL，rTaqE(5U/μL)0.25μL，ddH2O16.25μL。PCR条件为94℃预变性5min，后进行30个循环，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环结束后再72℃延伸10min。获得的中华绒螯蟹Elovl6基因核心片段克隆到pMD-19T载体并测序。（2）根据获得的delta6去饱和酶基因核心片段设计5’和3’RACE引物FAD6-5’(-)(其核苷酸序列如SEQIDNO:5)和FAD6-3’(+)(其核苷酸序列如SEQIDNO:6)。以Trizol法提取的中华绒螯蟹肝胰腺总RNA反转录合成5’-cDNA和3’-cDNA，分别以此cDNA为模板，进行RACE反应，获得5’和3’末端片段。将获得的末端片段分别连接至载体后克4隆并测序。5’-RACE反应体系为5’-cDNA模板2.5μL，10μM的5’-RACE引物0.5μL，10×UPM(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC)5.0μL，10mMdNTPMix1.0μL，50×Advantage2PolymeraseMix1.0μL，10×Advantage2PCRbuffer缓冲液5.0μL，加灭菌去离子水至总体积50μL。反应条件：94℃30s，72℃2min，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃2min，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃2min，28个循环，