专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段

多聚酶链式反应扩增DNA片段衡阳市一中吴世玉学习目标1．尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作。2．理解PCR的原理和反应过程。3．讨论PCR的应用。基础知识（一）DNA分子的结构1、DNA分子的基本组成单位？2、脱氧核苷酸的结构模式:脱氧核糖核苷酸，简称脱氧核苷酸。基础知识（一）DNA分子的结构3、多脱氧核苷酸链的结构模式:DNA的羟基(-OH)末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。基础知识（二）PCR原理请阅读《教材》P58内容，分析：1、DNA复制需要哪些基本条件？它们分别起什么作用？解旋酶：打开DNA双链；DNA母链：提供DNA复制的模板；4种脱氧核苷酸：合成子链的原料；DNA聚合酶：催化合成DNA子链；引物：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。基础知识（二）PCR原理请阅读《教材》P58内容，分析：3、DNA聚合酶的作用有何特性？DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。2、什么是引物？若要克隆DNA，需要加入几种特定的引物？【提示】引物是指能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的一小段DNA或RNA片段。克隆DNA时应加入两种引物。基础知识（二）PCR原理请阅读《教材》P58内容，分析：4、为什么DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸？DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3’端开始延伸DNA链。基础知识（二）PCR原理请阅读《教材》P58内容，分析：5、在生物体外如何将DNA的双螺旋打开？DNA的热变性原理：在80-1000C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程就称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这称为复性。PCR就是利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。基础知识（二）PCR原理请阅读《教材》P58内容，分析：6、高温能将将DNA的双螺旋打开，但同时也可能使DNA聚合酶失活，怎么办？耐高温的TaqDNA聚合酶的发现和应用解决了以上矛盾。基础知识（二）PCR原理小结：PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，并需要提供：DNA模板，两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶），同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。基础知识PCR一般要经历30多次循环，每次循环可以分为三步：变性、复性和延伸。在循环之前常要进行一次预变性（目的是增加模板DNA彻底变性的概率）。（二）PCR的反应过程基础知识（二）PCR的反应过程1．变性：当温度上升到____0C以上时，双链DNA解聚为单链。2．复性：温度下降到____0C左右，两种引物通过_____________与两条单链DNA结合。3．延伸：温度上升到___0C左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在___________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。9050碱基互补配对72DNA聚合酶基础知识从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。（二）PCR的反应过程383实验操作（一）设备及用具PCR仪、微量离心管、微量移液器等等。（二）PCR仪的循环程序预变性的目的:增加模板DNA彻底变性的概率。操作提示阅读教材P62。结果分析与评价DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。课题延伸快速、高效、灵活和易于操作是PCR的突出优点。可从基本的PCR中衍生出许多新方法。