一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法

说明书摘要1本发明涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，属于分子标记技术领域，所述的一组PCR特异性鉴别引物的核苷酸序列分别为CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重楼及其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势。摘要附图1权利要求书11．一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：所述的一组PCR特异性鉴别引物为：CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。2．根据权利要求1所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：其构建的具体步骤为：1）提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA；2）以步骤1）提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的PCR扩增产物进行测序；4）使用BioEdit软件对步骤3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点；5）利用primerpremier5.0软件设计一组特异性PCR鉴别引物。3．根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系总体积为25μL，反应体系包括20mM10×PCRTaqbuffer（Mg2+plus）、10mMdNTP、上下游引物各10μM、1UDNATaq聚合酶、1μLDNA模板、ddH2O补足25μL。4．根据权利要求2所述的一组PCR特异性鉴别引物，其特征在于：步骤2）中，PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min35个循环。5．一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：具体步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进权利要求书2行PCR扩增；3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。6．根据权利要求5所述的一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，其特征在于：步骤2）中，特异性PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min35个循环。说明书1一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法技术领域本发明属于分子标记技术领域，具体地说，涉及一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法。背景技术重楼属(ParisL.)是百合科多年生草本植物,《中国植物志》英文版中记载重楼属植物全世界约有39个物种,主要分布在欧亚大陆的热带至温带地区。该属植物在国内多做药用,其中滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)及华重楼[P.polyphyllavar.chinensis(Franch.)Hara.]收载于2005年版《中国药典》,是云南白药等多种中药的重要原料之一。然而重楼植物分类复杂,由于不同类群的特征性状交叉重叠，各类型界限模糊不清，给重楼药用植物鉴定带来困难。近年来，随着对重楼需求量的增大，野生重楼资源急剧减少，采集野生滇重楼不能满足市场需求,更破坏了生态环境和滇重楼资源，寻找鉴定重楼药材的有效方法迫在眉睫。有关重楼植物鉴定，已有形态学、细胞学(包括核型和染色体多态性)和RAPD、AFLP等DNA分子标记方面的研究，这些研究都为重楼属药用植物的鉴定提供了依据。而位点PCR技术直接利用DNA序列进行物种的鉴定，具有独一无二的可重复性，为药用植物鉴定带来了新的机遇。目前，运用DNA分子标记技术对重楼属植物进行鉴定上，有学者运用过对滇重楼（P.polyphyllavar.yunnanensis）、南重楼（Parisvietnamensis）与华重楼（P.polyphyllavar.chinensis）等11个物种，比较几种片段各序列扩增和测序效率、种内和种间变异(朱英杰,陈士林,姚辉,谭睿,宋经元,罗焜,鲁静.重楼属药用植物DNA条形码鉴定研究[J].药学学报.2010(03))。也有学者采用扩增叶绿体说明书2psbA-trnH序列计算种内和种间遗传距离，构建邻接树(neighbor-joiningtree)进行滇重楼及其同属物种的鉴定(刘涛，赵英良，杨莹等.滇重楼的psbA-trnH条形码分子鉴定研究[J].天然产物研究与开发，2015，27:758-762)。上述技术显示了DNA条形码在滇重楼药材真伪鉴别应用的可能性，本发明利用特异性位点PCR的技术，克服了传统鉴别方法中样品量大，主观性大等问题，将之和南重楼、长柱重楼、大理重楼等进行鉴别的分子标记鉴定技术的报道尚未见到。发明内容为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义，且操作简单、鉴别快速。为实现上述目的,本发明是通过如下技术方案实现的：一组PCR特异性鉴别引物为：CL-F：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’；CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。进一步地，一组PCR特异性鉴别引物的构建步骤为：1）提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA；2）以步骤1）提取的基因组DNA为模板，使用通用引物ITS2对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的PCR扩增产物进行测序；4）使用BioEdit软件对步骤3）的测序结果进行序列分析，校对和对比，找说明书3出滇重楼特有的变异位点；6）利用primerpremier5.0软件设计一组特异性PCR鉴别引物（CL-F，CL-R）。进一步地，步骤2）中，PCR反应体系总体积为25μL，反应体系包括20mM10×PCRTaqbuffer（Mg2+plus）、10mMdNTP、上下游引物各10μM、1UDNATaq聚合酶、1μLDNA模板、ddH2O补足25μL。进一步地，步骤2）中，PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min35个循环。一种采用PCR特异性鉴别引物鉴别滇重楼的方法，具体步骤为：1）提取待测样品的基因组DNA；2）以步骤1）中提取的基因组DNA为模板，使用特异性PCR鉴别引物对其进行PCR扩增；3）对步骤2）的扩增产物进行电泳检测，在130bp处检测出条带的待鉴定样品鉴定为滇重楼，在130bp处未检测出条带的待鉴定样品为其他植物材料。进一步地，步骤2）中，特异性PCR反应体系的热循环程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火45s，72℃延伸1min，72℃延伸10min35个循环。本发明的有益效果：本发明摒弃了植物表观性状易于变化的干扰，不受环境因素、植物生长期的影响，直接从DNA分子水平对物种进行鉴定，更能揭示物种的遗传本质，打破了依赖植物开花期作为滇重楼及物种鉴定的局限，对滇重楼的准确引种栽培、规范商品市场以及临床应用有着重要的现实意义；本发明只需要进行PCR，然后取PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检说明书4测方面具有独特的优势，非常有利于中药的快速鉴别。附图说明图1为滇重楼及其混淆品总DNA的电泳检测图谱；图2为滇重楼及其混淆品通用引物ITS2扩增的电泳检测图谱；图3为滇重楼及其混淆品鉴别引物的电泳检测图谱。图中，1.滇重楼Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch)Hand.-Mazz；2.毛重楼ParisaireiLeveille；3.多叶重楼ParispolyphyllaSmithinRees；4.七叶一枝花(长狭叶)Parispolyphyllavar.chinensis(Franch.)Hara；5.大理重楼ParisdaliensisH.Li&V.G.Soukup；6.南重楼Parisietnamensis(Takhtajan)H.L；7.长柱重楼Parisforrestii(Takht.)H.Li；8.七叶一枝花Parispolyphyllavar.chinensis(Franch.)Hara；9.五指莲重楼ParisaxialisH.Li；10.阴性对照。具体实施方式引物设计提取滇重楼及其混淆品的基因组DNA，选择通用引物ITS2对滇重楼和混淆品进行扩增，扩增后样品送至上海生工生物公司测序。滇重楼以及其伪品ITS2片段测序所得结果使用BioEdit软件进行序列分析，校对和对比，找出滇重楼特有的变异位点，发现滇重楼变异位点较多，190bp处滇重楼为A，七叶一枝花-长狭叶为T，而其他混淆品为C，203bp处为C，而其他混淆品均为T，206bp处滇重楼为G，而其他混淆品均为C，275bp处滇重楼为A，而其他混淆品均为C，276bp处滇重楼为G，而其他混淆品均为C，320bp处滇重楼为A，而其他混淆品均为G，331bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，363bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，389bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，391bp处滇重楼为T，而其他混淆品均为C，利用primerpremier5.0软件，选择203bp说明书5和331bp处的位点设计1对特异性PCR引物（CL-F,CL-R），其核酸序列分别如下：ITS2F：5’—ATGCGATACTTGGTGTGAAT—3’ITS3R：5’—GACGCTTCTCCAGACTACAAT—3’CL-F:：5’—CGCGTACAACGAAACCATGCTGGGC—3’CL-R：5’—GAAGAGTGGGATGCCAACTGAGACC—3’。实施例1）材料、试剂与仪器a.材料材料如下表1所示，分别为滇重楼、毛重楼、多叶重楼、七叶一枝花-长狭叶、大理重楼、南重楼、长柱重楼、七叶一枝花和五指莲重楼。表1样品来源表中文名称拉丁学名收集地收集时间滇重楼Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch)Hand.-Mazz云南昆明2015毛重楼ParismaireiLeveille云南文山2015多叶重楼ParispolyphyllaSmithinRees云南昆明2015七叶一枝花（长狭叶）Parispolyphyllavar.chinensis(Franch.)Hara云南文山2015大理重楼ParisdaliensisH.Li&V.G.Soukup云南文2015说明书6山南重楼Parisvietnamensis(Takhtajan)H.L云南文山2015长柱重楼Parisforrestii(Takht.)H.Li云南昆明2015七叶一枝花Parispolyphyllavar.chinensis(Franch.)Hara云南昆明2015五指莲重楼ParisaxialisH.Li云南昆明2015b.试剂琼脂糖(美国Promega公司)；DL2000(北京鼎国昌盛公司)；2×PCRMasterMix(上海生工生物科技有限公司)；核酸染料(北京鼎国昌盛公司)；引物为上海生工生物科技有限公司合成。c.仪器PCR仪(