不同加工工艺桑叶茶的主要理化成分与微生物群落检测研究

-1-不同加工工艺桑叶茶的主要理化成分与微生物群落检测研究水冬芳袁珂叶飞浙江万里学院生物与环境学院生物技术专业指导教师：王忠华博士茶是深受人们喜爱的饮品，它含有多种有机成分和人体必需的微量元素。微量元素(TE)与人体健康有着密切的关系，对生物体内的免疫系统起着重要的调节作用，并能通过体内的酶系统发挥对机体代谢功能的协调和控制，从而提高机体的免疫功能，达到抗菌和抗病毒的效果[1]。于是研究茶叶中的微量元素就非常重要了。并且随着人们生活质量的不断提高、健康意识的日渐增强，因而对茶叶的卫生质量也提出了更高的要求。茶叶的卫生质量包括三个方面：农药残留、重金属以及微生物污染状况。目前，茶叶中农药残留和重金属含量超标的问题已引起广泛重视，对于茶叶中有害微生物等污染情况的研究却很少，但有害微生物的检验越来越为发达国家所重视。近年来，随着人民生活水平的提高，日常摄入事物的数量和质量都有很大的变化，居民每日摄入大量的高蛋白、高脂肪食物，导致了肥胖、亚健康人群和糖尿病、高血脂、心脑血管等患者的大量增加，越来越多的人开始关注绿色健康，绿色食物，于是桑叶进入了人们的视线。桑叶被称作“神仙叶”，是一味常用中药，应用广泛。桑树原产于中国和朝鲜，全球约有16种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区，我国约有11种，分布于全国大部分地区，以长江流域尤其江浙一带为多[2]。栽桑养蚕是我国农业的传统产业，桑树在我国已有4000多年的栽培历史，是世界上最大的桑树种植国，主要有家桑或白桑（Morusalba）、鸡桑（M.australis）、华桑（M.cathayana）、蒙桑（M.Mongolic）、山桑（M.diabolica）等10多个种和变种[3]。科学研究证明，桑叶是一种营养结构非常丰富的天然物质，含有多种维生素、矿物质、氨基酸、生物碱、粗蛋白、植物纤维、无机盐、挥发油、黄酮和多酚类等成分,还含有锌、锰、钙、铁等营养元素，处于生长期的桑叶中，水分约占75%，干物质25%左右。干物质中，粗蛋白约为29%，粗脂肪为5%，可溶性碳水化合物约20%，有机酸为3%，灰分为12%，其具有药性平和、无毒副作用等特点，属于既是食品又是药品”之列。传统医学认为，桑叶性味：甘、平、寒；具有清肝明目聪耳，镇静神经的功能，对人体具有疏散风热、消肺润燥、明目、凉血等作用。桑叶还具有抗应激、抗衰老、增强机体耐力、降低血清胆固醇以及调节肾上腺素功能等效果。经常饮用桑叶茶有减少皮肤或内脏中脂褐质(即老年斑)的积滞和降低血脂、血糖等作用，且易于吸收，具有平肝明目、疏风清热的功效。桑叶茶的生产加工工艺与普通茶叶类似，需经采桑、洗晾、切叶、杀青、揉搓、解块、烘干、-2-制香等工序。这种茶不含咖啡因，香醇爽口。武深秋[4]用桑叶配伍菊花作茶饮，可用于预防治疗外感风热感冒，用桑叶配伍杜仲叶作茶饮，可用于治疗多年缺血性心绞痛和肾虚引起的腰痛，并两者均有显著效果。居跃君[5]用内含桑叶的平肝安神汤治疗高血压病伴失眠症102例，总有效率达82.35%。孙秀凤[6]临床研究表明，桑菊茶饮具有疏风清热、润喉止咳的功效。随着人们对桑叶的化学成分、药理作用、临床作用等方面进行的较深入研究，其在医药和食品领域中得到了广泛的应用。目前桑叶新用途的开发利用正在形成一股新的潮流，对蚕桑业、医药业等产生着巨大的影响[7]。又由于环保、绿色食品、健康消费是21世纪人们消费的主题，天然无公害保健品的开发及生产，将成为今后食品工业长期发展的必然方向。因此，我们将传统的制茶工艺与保健功能独特的桑叶有机结合，开发出新品桑叶茶并加以产业化、规模化，为农业增效农民增收找到了一个新的亮点。随着这些热点的产生，越来越多的人开始花更多的时间在于研究桑叶的副产品，而桑叶茶就是其中之一。本试验是按照传统绿茶、红茶和乌龙茶的加工工艺，将同一批桑树鲜叶分别加工成桑叶绿茶、桑叶红茶、桑叶乌龙茶并和桑叶固定样一起对其茶汤色泽、感官评审、含水量、水浸出物、黄酮含量、可溶性糖含量、多酚类物质的含量、氨基酸含量及重金属含量等进行具体的分析处理并研究了其浸出液中微生物群落分布与含量。现虽由大量数据表明桑叶茶对人体的健康具有重大的影响，但是存在的大多为单一的化学成分的探讨，所以我们同时测定分析其多个化学成分对其性质的影响并检测其中重金属含量、微生物群落分布与含量，旨在为开发营养功能性食品，为居民的养生保健提供科学理论依据。1材料与方法1.1试验材料与仪器试剂1.1.1试验材料供试材料为果桑品种“大十”的嫩叶，采自宁波市鄞州区下应镇天宫庄园果桑种植基地。于10月27日上午8：00-11：00（天气晴朗）采摘鲜叶，采摘时以选取无污染、无病虫害的完整叶片为好，保持嫩度均一。将同一批桑树鲜叶混匀后分成4份，其中一份制作桑叶固定样，另外3份分别用传统绿茶、红茶和乌龙茶等茶叶加工工艺制作桑叶茶样[8]，以备试验分析。1.1.2主要仪器设备表1主要仪器设备设备名称规格出产地-3-1.1.3主要药品试剂70%乙醇溶液；茚三酮试剂；茚三酮粉末；磷酸氢二钠；磷酸二氢钾；1/15M磷酸缓冲液；盐酸；氯化亚锡；谷氨酸标准样品；磺基水杨酸；18种氨基酸标准样品（日立公司）；蛋白胨；牛肉膏；氯化钠；琼脂；氢氧化钠；75%乙醇（V/V）；王水；重铬酸钾；浓硝酸；浓硫酸；硫酸铜；硫酸锌；金属镍；金属铅；1.2试验方法1.2.1试验材料的制备1.2.1.1桑叶固定样的制备采用微波固样法[9]，桑叶在高火的情况下，微波杀青90s即可杀匀杀透；接着将样品置于烘箱中80℃烘6小时至足干。用于生化分析的各样品，按照GB8303-87《茶磨碎式样的制备及其干物质含量测定》的规定，磨碎，过40目筛，密封保存。瓶式炒干机6CCP-110浙江武义增荣食品机械有限公司摇青机6CY-16福建剑光茶叶机械有限公司揉捻机6CR-35福建剑光茶叶机械有限公司烘箱DMH北京奇纳尔电热电器有限公司小型磨碎机XFB-200广州汇新机械设备有限公司过筛机FS江苏省江阴市华力干燥有限公司电子天平BS-224-S北京赛多利斯仪器系统有限公司恒温水浴锅HH-S1上海申生科技有限公司紫外分光光度计UV757CRT上海华岩仪器设备有限公司可见分光光度计723PC上海华岩仪器设备有限公司氨基酸自动分析仪835-50上海科学仪器厂，日立公司高速冷冻离心机Fresco17德国3510原子吸收分光光度计3510安捷伦上海分析WM-2H型无油气体压缩机WM-2H天津市医疗器械二厂RX2型智能化人工气候箱RX2-300C宁波江南仪器厂水浴锅Polystatcc3德国不锈钢立式蒸汽灭菌器LDZX-150KBS上海申安医疗器械厂-4-1.2.1.2绿茶工艺桑叶茶的制备按照烘青绿茶加工工艺流程：鲜叶—摊放—杀青—揉捻—干燥，将桑树鲜叶加工成桑叶绿茶。摊放时间以水分丧失20%左右为宜，杀青要求杀匀杀透。1.2.1.3红茶工艺桑叶茶的制备按照红茶的加工工艺流程：鲜叶—萎凋—揉捻—发酵—干燥，将桑树鲜叶加工成桑叶红茶。鲜叶经过1h的日光萎凋和12h的室内萎凋后，在6CR-45型揉捻机上轻揉10min，加重压揉捻50min成条索状，然后室温发酵4h，即可烘至足干。1.2.1.4乌龙茶工艺桑叶茶的制备按照乌龙茶的加工工艺流程：鲜叶—晒青（15min）—晾青—碰青—摊青（1h）—一次摇青（2min）—摊青（2h）—二次摇青（4min）—摊青（3h）—杀青—揉捻—干燥，将桑树鲜叶加工成桑叶乌龙茶。将桑叶固定样、桑叶绿茶、桑叶红茶和桑叶乌龙茶这四种桑叶样品在80℃的烘箱中烘6小时，等到彻底烘干后取出在小型磨碎机上磨碎，过40目筛，用密封袋将筛下粉末分别装袋，标上标签供试。1.2.2试剂的配置0.2%茚三酮试剂的配制方法：称取1g茚三酮粉末，溶于25mL水中，加入SnCl240mg，搅拌溶解后放置一昼夜，然后过滤，滤液加蒸馏水定容到50mL，备用。1/15M（pH8.0）磷酸缓冲液的配制方法：取磷酸氢二钠缓冲液95mL（称取23.877g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O），加水溶解后定容至1L）和磷酸二氢钾缓冲液5mL（称取9.078g磷酸二氢钾(KH2PO4)，加水溶解后定容至1L）混合均匀配成pH8.0磷酸盐缓冲液，备用。铜标准贮备液[ρ(Cu)=1000μg/ml]：称取3.928g硫酸铜（CuSO4`5H2o,未风化），溶于水中，移入1L容量瓶中，加5ml1：5硫酸溶液，稀释至刻度，混匀。铜标准溶液[ρ(Cu)=100μg/ml]：吸取铜标准贮备液10.00ml于100ml容量瓶中，用水定容；锌标准贮备液[ρ(Zn)=1000μg/ml]：称取4.398g硫酸锌（ZnSO4`7H2o,未风化），溶于水中，移入1L容量瓶中，加5ml1：5硫酸溶液，稀释至刻度，混匀。锌标准溶液[ρ(Zn)=100μg/ml]：吸取锌标准贮备液5.00ml于100ml容量瓶中，用水定容；镍标准贮备液[ρ(Ni)=1000μg/ml]：镍标准贮备液：称取光谱纯金属镍1.0000g，准确到0.0001g，加硝酸(3.1)10mL，待完全溶解后，用去离子水稀释至1000mL，每毫升溶液含1.00mg镍。标准工作溶液：移取镍贮备液(3.6)10.0mL于100mL容量瓶中，用硝酸溶液(3.4)稀释至标线，摇匀。铅标准贮备液[ρ(Pb)=1000μg/ml]：称取0.5000g金属Pb置于100ml烧杯中，加入20ml：2HNO3溶液，加热出去NO2，冷却后转入500ml容量瓶中，用二次水稀释至刻度。铬标准贮备液[ρ(Cr)=1000μg/ml]：将K2CrO7在120℃下干燥至恒重，再称取3.37349g-5-溶于水转入1000ml容量瓶，用二次水稀释至刻度。铬标准溶液[ρ(Cr)=100μg/ml]：吸取铬标准贮备液10.00ml于100ml容量瓶中，用水溶解后定容至1L，贮于塑料瓶中；盐酸溶液[C（HCL）=0.1mol/L]:吸取8.3ml浓盐酸于去离子水中，稀释至1L。（1+1）王水溶液：取3份盐酸（优级纯，ρ=1.19g/cm3）与1份浓硝酸（优级纯，ρ=1.40g/cm3）混合，然后用二级水稀释一倍。保存液：取0.5g重铬酸钾（K2Cr2O7，优级纯），用少量水溶解，加50ml浓硝酸（优级纯，ρ=1.40g/cm3），用水稀释至1L，摇匀。稀释液：取0.2g重铬酸钾（K2Cr2O7，优级纯）溶于900ml水，加入28ml浓硫酸（优级纯，ρ=1.84g/cm3），用水稀释至1L，摇匀。营养琼脂培养基的配置方法：称取蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水中，加入15％氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2～7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。1.2.3感官审评由5名试验人员组成审评小组（其中2人为国家高级评茶员），对桑叶茶采用“双盲”测试法进行感官审评，即对桑叶茶编号，使审评人员在不知道桑叶茶具体工艺的情况下，根据GB/T14487-93《中国人民共和国茶叶感官审评术语》[10]对桑叶茶的品质特点进行感官评定。桑叶茶的冲泡方法为称取约3g样品，用沸水冲泡5min后出汤，从汤色、香气、滋味、叶底等方面描述不同加工工艺桑叶茶的品质。1.2.4蛋白质含量的测量蛋白质含量可采用紫外分光光度法来进行测定[11]。取四种样品的粉末各5g，置250mL三角烧瓶中，加70%乙醇溶液50mL，超声波提取30分钟，过滤液，取滤液置紫外分光光度计上，在波长280nm和260nm处分别测定其吸光度；70%乙醇可作为紫外分光光度计的空白对照。利用下列公式计算蛋白质的浓度：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260（其中A280----280nm处测得的吸光度值，A260----260nm处测得的吸光度值）1.2.5氨基酸总量的测定桑叶茶的氨基酸总量参照GB/T8314-87（茚三酮比色法）[12]进行测定。氨基酸标液的配制：称干燥的谷氨酸0.1000g→用二次蒸