万寿菊植物不同部位中光活化成分a—三联噻吩在不同生长期的含量

1万寿菊植物不同部位中光活化成分a—三联噻吩在不同生长期的含量莫卓群杨华管金星（长沙今草生物科技有限公司湖南长沙410000）摘要：a-三联噻吩（a-T）是一种光活化杀虫剂，它是一种优良的光活化毒素。本文采用高效液相色谱法对陕西西安地区万寿菊同一品种的根、茎、叶、花柄、花、根乙醇提取物在不同生长时期连续4年时间的a—T含量测定。方法：采用Phenomenexprodigy5μmODS3100A(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相为甲醇—水（85:15），流速1.0ml/min，检测波长351nm，柱温35℃。结果：a—T进样量在0.0495~2.475µg（R2=0.9995）与峰面积呈线性关系；平均回收率（n=6）为101.07%。结论：本方法具有较高的灵敏度和较好的重现性，快速便捷，专属性强，结果准确，适用于万寿菊及其根乙醇提取物中a-T的含量测定。结果显示根的含量最高，其次是花柄、花、叶，含量最低的是茎；不同生长期根的a—T含量差异显著，7月含量最高，9月最低。花柄和花8月含量高。茎的含量很低，含量变化不明显。根乙醇提取物含量随根含量变化而变化，产率7月份的最高。万寿菊花的采集时期在8—9月为最佳，也就是在植物盛花末采集。关键词：万寿菊a-三联噻吩光活化杀虫剂反相高效液相色谱万寿菊(TageteserectaL)，又名：金盏花（Marigold）,臭芙蓉，菊科、万寿菊属，一年生草本，高50∽150厘米；茎直立，粗壮，具纵细条棱，分枝向上平展；叶羽状分裂，长5∽10cm，宽4∽8cm，裂片长椭圆形或披针形，边缘具锐锯齿，上部叶裂片的齿端有长细芒，沿叶缘有少数腺体，基部收缩成长爪，顶端微弯缺；头状花序单生，管状花花冠黄色，花期7-9月；原产墨西哥，我国各地均有栽培。可生长在海拔1,150米至1,480米的地区，多生在路边草甸。万寿菊常于春天播种，花大、花期长，常用于花坛布景，可供观赏。根：苦、凉；解毒消肿，用于上呼吸道感染，百日咳，支气管炎，眼角膜炎，咽炎，口腔炎，牙痛。叶：甘，寒；用于痈、疮、疖、疔，无名肿毒。花序：苦，凉，平肝解热，祛风化痰，用于头晕目眩，头风眼痛，小儿惊风，感冒咳嗽，顿咳，乳痛，痄腮。花：清热解毒，化痰止咳，有香味，可作芳香剂，曾用作抑菌、镇静、解痉剂。我国万寿菊的种植面积较广，万寿菊花花朵盛茂，产花率极高，花中叶黄素含量很高[1]，主要用来提取叶黄素，是提炼叶黄素及类胡萝卜素的主要原料；叶中的精油可用来杀没灭瓜果的腐霉病；其根含有黄酮、生物碱和特殊的活性物质而备受重视，成为从2400种记载的控害植物中挑选出来的43种广谱控害植物之一，被誉为“控害植物精华”[2]。万寿菊的根提取物对小菜娥（Plutellaxylostelle）、欧洲玉米螟（Ostrinianubilalis）、烟草天蛾（Manducasexta）、白纹伊蚊（Aedesalbopictus）[3]、埃及库蚊（A.aegypti）、中华按蚊（Anophelessinensis）、谷蠢（Rhizonerthadominica）、黄粉甲（Tenebriomolitor）、山楂叶螨（Tetranychusviennensis）等有较好的毒杀活性，并且以光活化活性为主[3，4，12]。万寿菊的根提取物对多种线虫的杀虫活性的主要杀虫活性成分是噻吩类物质，其中的主要物质是BBT、BBTOAc、BBTOH和a-三联噻吩[5，13]；（a—T）在所有器官（根、茎、叶、花）有都存在[14]。a—T是一种光活化杀虫剂【6,8】，它是一种优良的光活化毒素，在光照时其杀虫活性成几十倍的提高[11]。A—T在阳光下的半衰期为4h，发挥杀虫作用的过程也是活性成分本身降解的过程，不会在环境中持久残留，被称为“绿色农药——光活化农药”[7]。2因植物性杀虫剂的来源受到地域、季节、土地资源、生态条件、气候等诸多因素的制约，因此不同地区种植的不同品种的万寿菊其有效成分含量不同[9]。长沙今草生物科技有限公司和陕西西安地区某万寿菊种植基地从2011年开始研究万寿菊的种植和综合开发。本文以陕西西安地区某万寿菊种植基地种植的万寿菊为研究试材，采用高效液相色谱法测定了2012年至2015年四年时间同一品种的根、茎、叶、花柄、花和根乙醇提取物在不同生长时期（采样日期为每月20日）中a—T的含量[10]，为综合开发利用万寿菊和工业化生产提供支持。1仪器和试药1.1主要仪器Agilent1260仪（G1311B，VWD：G1314F，7725i进样器，ChemStation中文色谱数据工作站），MS105DU电子天平（Mettler，0.01mg），FA1104电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司，0.1mg），KQ5200B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），LU5A5-PCP-2A反渗透净水机（深圳立昇净水科技有限公司），SYZ-550型石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏省金坛市白塔石英玻仪厂），RE-3000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），DZF-6020MBE真空干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂），SHB-III循环水式真空泵（郑州长城科工贸有限公司），B-220可调恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂），JJ-1.25W精密增力电动搅拌器（常州国华电器有限公司），GY-10A500克多功能粉碎机（江西赣州市客家大道180号），酒精计。1.2化学试剂甲醇为色谱纯（SpectrumHPLCGrade），乙醇等其余试剂均为分析纯，水为超纯水。a—T对照品（纯度≥99.0%,美国Aldrich公司）。万寿菊（整株）采自陕西西安某万寿菊栽培基地。万寿菊根乙醇提取物自制。2方法32.1对照品溶液的制备精密称取α—T对照品1.25mg（精确至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入色谱纯甲醇约45ml，超声（功率300W，40KHz）溶解20min，溶解完全后，冷却至室温，加甲醇定容，充分摇匀。使用时过0.45μm滤膜即可(对照品浓度24.75μg/ml)，备用。2.2供试品溶液的制备2.2.1原药材供试品溶液的制备每次随机摘取30株万寿菊，清洗泥沙等杂物，阴凉处沥干水分，将每株的根、茎、叶、花柄（序）、花分别整理后合并，分别在35℃∽38℃电热鼓风干燥箱中干燥48.0h，冷却至室温，粉碎，过60目筛，得万寿菊原药材各部位供试样品。取10.0g供试样品在105℃条件下恒温8.0h测定水分。精密称取万寿菊原药材各部位供试样品2.5g（精确至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入甲醇（A.R.）约45ml，超声（功率300W，40KHz）提取40min，冷却至室温，加甲醇定容，充分摇匀。过0.45μm滤膜即可。2.2.2万寿菊根乙醇提取物供试品溶液的制备精密称取过60目筛的根乙醇提取物80.0mg（精确至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入甲醇（A.R.）约45ml，超声（功率300W，40KHz）溶解20min，冷却至室温，加甲醇定容，充分摇匀。过0.45μm滤膜即可。2.3检测波长的选择采用PAD检测器对1μg/mL的a—T在流动性中在190nm∽400nm扫描，a-T最大吸收波长为352nm，选择351nm为检测波长，信噪比高，极限稳定，待测组分峰形对称。2.4色谱条件Phenomenexprodigy5μmODS3100A(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相为甲醇—水（85:15，V甲醇/V水），流速1.0ml/min，检测波长351nm，柱温35℃，进样量10.0μL，采用外标法定量分析。a—T理论塔板数大于5000，对称因子为0.99。对照品及供试品色谱图见图2。4图2a—T对照品、万寿菊根（2013年8月）和万寿菊根乙醇提取物（2013年8月）HPLC2.5万寿菊根乙醇提取物的制备5称取过60目筛的万寿菊根样品100.0g（精确至0.1g），置于1000ml三颈圆底烧瓶中，第Ⅰ次加入70%乙醇水溶液700mL，浸提8.0h，然后在搅拌下65℃提取1.5h，冷却至40℃抽滤；滤渣进行第Ⅱ次提取，加入70%乙醇水溶液500mL，搅拌下65℃提取1.5h，冷却至40℃抽滤；滤渣进行第Ⅲ次提取，加入70%乙醇水溶液400mL，搅拌下65℃提取1.0h，冷却至40℃抽滤。合并提取滤液，在60℃，P≤-0.095MPa下回收乙醇完全，置75℃∽80℃，P≤-0.095MPa真空干燥至水分小于1.0%，取出置干燥器中冷却，粉碎过60目筛，得万寿菊根乙醇提取物。2.6测定在上述色谱条件下，待仪器稳定后，先注入数针对照品溶液，计算各针峰面积，直至对照品溶液峰面积变化小于1.0%，按照标样、试样、试样、标样的顺序测定。2.6.1a—T的含量测定按下式计算A—T含量%=[（A样×M标×N标%）/（A标×M样）]×100%式中：A样————样品溶液样品的峰面积；A标————对照品溶液对照品的峰面积；M样————样品的质量（mg）；M标————对照品的质量（mg）；N标%————对照品的质量百分含量（%）。2.6.2样品中a—T含量%=[A—T含量%/（100（%）–水分含量（%））]×100%。2.7允许差每个样品平行测定3次，其结果之差应小于0.5%，取平均值作为测定结果。2.8标准曲线的测定精密称取α—T对照品12.5mg（精确至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入色谱纯甲醇约45ml，超声（功率300W，40KHz）溶解20min，溶解完全后，冷却至室温，加甲醇定容，充分摇匀(对照品浓度247.5μg/ml)。准确吸取对照品溶液各0.2mL，1.0mL，2.0mL，4.0mL，6.0Ml,10.0mL于10ml棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度得6个不同浓度的对照品液。按上述色谱条件测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标分别得线性方程：y=66340X-18.80,R2=0.9995。线性范围a—T为0.0495~2.475µg。2.9精密度实验精密吸取a—T对照品进样6次，峰面积RSD为0.56%，进样方法和仪器精密度良好。6表1-1精密度实验数据重复峰面积RSD%123456结果1619.61601.81610.21622.51605.21623.60.562.10重现性实验取同一批次万寿菊根原药材，分为5份，以2.2.1制备方法制备5份样品液，分别测定a—T峰面积，RSD%为0.89%，重现性良好。2.11稳定性实验取同一批次万寿菊根乙醇提取物供试品溶液，避光放置0、1、2、4、8、12、24h进样测得a—T峰面积的RSD%0.97%，表明供试品在避光条件下24h内基本稳定。2.12加样回收实验精密称取已知含量的万寿菊根乙醇提取物6份，精密加入a—T对照品液2ml、4ml、6ml按供试品制备方法操作，测定；a—T平均回收率为101.07%，RSD%为1.15%。3结果与分析对2012年至2015年于每年7月20日、8月20日、9月20日采摘的同一品种的根、茎、叶、花柄、花、根乙醇提取物的供试样品进行a—T测定。7表2万寿菊及根提取物中a—T的含量年份采摘根±SE茎±SE叶±SE花柄±SE花±SE根提取物±SE根提取物产率时间（PPm）（PPm）（PPm）（PPm）（PPm）（PPm）（%）2012年7月155.0±0.574.8±0.742.8±0.64∕∕1083.8±0.8114.38月135.6±0.623.1±0.779.7±0.8629.9±0.7125.7±0.621084.7±0.9512.59月84.7±0.714.2±0.936.1±0.420.8±0.78∕830.3±0.7510.22013年7月154.8±0.973.9±0.442.5±0.7429.9±0.8026.7±0.231113.6±0.7913.98月136.2±0.824.0±0.578.2±0.7631.2±0.7828.5±0.691107.3±0.6712.