临床放射生物学

临床放射生物学广西医科大学附属肿瘤医学院放疗科黄江琼教学目的：1、掌握肿瘤的放射生物学基础，分次放射治疗的生物学基础及正常组织的放射性损伤2、熟悉电离辐射对细胞的杀灭概念，细胞存活概念，氧效应与氧增比，靶学说与α/β模式，肿瘤放射治疗中生物剂量等效换算的数学模型，改变放射效应的措施3、了解电离辐射生物效应的基本过程，放射线对生物体的作用，细胞生存曲线。教学内容：1、放射线对生物体的作用：2、电离辐射对细胞的杀灭概念及细胞存活的概念；3、氧效应与氧增比；4、靶学说α/β模式；5、肿瘤放射治疗中生物剂量等效换算的数学模型；6、肿瘤的放射生物学；7、分次放射治疗的生物学基础；8、正常组织的放射损伤；9、改变放射效应的措施。授课时数：3.0学时放射治疗的地位放疗18%手术22%化疗5%未治愈55%1999年Tubiana报告45%的恶性肿瘤可以治愈。放射肿瘤学的内容放射肿瘤学临床肿瘤学放射物理学放射生物学临床放射生物学实验放射生物学放射治疗学放射生物学对放射治疗的影响1.阐明肿瘤和正常组织辐射损伤的机制、过程2.有助于放疗的新的治疗方法的建立3.为前瞻性临床试验提供备选治疗方案放射治疗的两大基本原则最大程度地杀灭肿瘤最大程度地保护正常组织第一节电离辐射生物效应的基本过程电离辐射是指能引起被作用物质电离的放射线电磁辐射:X射线和γ射线，均为光子电离辐射粒子辐射：质子、中子电离辐射的一个重要特点是能够在被作用物质的局部释放能量，引起被作用物质的电离和激发，而电离和激发又是电离辐射原初作用的重要环节。二、电离和激发(一)电离作用电离作用是高能粒子和电磁辐射的能量被生物组织吸收后引起效应的最重要的初始过程。定义：生物组织中的分子被粒子或光子流撞击时，其轨道电子被击出，产生自由电子和带正电的离子，即形成离子对，这过程称之。(二)激发作用定义：当电离辐射与组织分子相互作用，其能量不足以将分子的轨道电子击出时，可使电子跃迁到较高级的轨道上，使分子处于激发状态，这一过程称为激发作用。(三)水的电离和激发生物体是由各种物质的分子所组成，除生物大分子和无机分子外，水占生物体重的70％左右。电离辐射作用于机体生物大分子的同时，也作用于机体的水分子。电离辐射作用于水分子而产生的活性产物又可进一步影响生物大分子水分子受电离辐射作用时，发生电离和激发作用。使水分子产生羟自由基(·OH)和氢自由基（H·）。水的电离HOH→HOH++e-HOH+→H++OH.OH.+OH.=H2O2自由基freeradical在其外层轨道上有一个未配对的电子，高度活跃三、自由基与放射损伤细胞生物学基本概念•在所有生物体中，能独立存在的最小单位是细胞。•细胞的结构：细胞核和胞浆。•胞浆与放射生物效应的关系较小，•细胞核是产生辐射效应的主要部位。细胞核的主要成分是DNA•DNA是辐射引起细胞死亡及损伤的主要靶区2．自由基对DNA的损伤作用：自由基对DNA作用后果主要有三类：即单双链断裂、无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)和产生环胞和嘧啶衍生物。第二节放射线对生物体的作用一、放射线对生物体的作用方式(一)三阶段作用过程：任何生物体经照射后均产生一系列的变化过程，这些变化的时间过程有很大差异，以时间过程分可分为三个时相：物理过程化学过程生物阶段高速运转的电子以10-18S的速度通过DNA分子及以10-14S的速度穿过哺乳动物细胞，因而产生了一系列的电离和激发的过程。DNAe-10-18S细胞10-14Se-物理过程：即包括带电粒子和组成组织的原子之间的相互作用过程。电离、激发其次是化学过程即受到损伤的原子和分子细胞中其他的结构起快速的化学反应形成自由基，并参予一系列的反应最后导致电子负荷平衡的重建，自由基反应一般在照射后千分之一秒内完成。最后是生物阶段大量的占多数的损伤如DNA内的损伤都可以成功的修复仅有较少的损伤不能修复，这些未能修复的损伤最后导致细胞死亡。电离辐射生物效应的时标:(Thetime-scaleofeffectsinradiationbiology)物理过程（10-15秒内结束）。化学过程（DNA残基的存在时间10-3到10-5）秒）。生物学过程（细胞死亡需数天到数月，辐射致癌作用需数年，可遗传的损伤需经数代才能观察到(二)放射线的生物效应直接作用间接作用直接作用Directaction直接作用—射线被生物物质吸收时,直接和细胞关键的靶起作用，靶原子被电离或激发启动一系列生物事件导致生物改变。破坏肌体的核酸、蛋白质和酶等具有生命功能的物质。本质：射线直接造成生物大分子损伤效应高LET射线，如中子或α粒子间接作用Indirectaction电离辐射作用于一个原子和分子的同时又直接作用于水，使水分子产生一系列原发辐射分解产物，然后通过这些辐射分解产物再作用于生物大分子，引起后者的物理和化学变化本质：通过水电离。间接作用Indirectaction水的电离常见，细胞80%是水每个DNA分子，含1.2X107个水分子deltaraysIonizationevent(formationofwaterradicals)Lightdamage-reparableClustereddamage-irreparableRadiationDamagetotheDNAWaterradicalsattacktheDNAThemeandiffusiondistanceofOHradicalsbeforetheyreactisonly2-3nmOH•e-Primaryparticletrack第五节电离辐射对细胞的杀灭概念一、克隆源性细胞的概念：在正常的更新组织内，要保持体内一个组织的体积和组织的功能，有赖于组织内存在的小部分原始的“干细胞”。干细胞是有能力保持自己的数量，同时产生可以分化和增殖的细胞以替代其他功能性细胞群。一个肿瘤内干细胞仅是很小的一部分。癌瘤是从这些等级组织衍生出来的，但并非肿瘤内的细胞都是恶性干细胞。当一个肿瘤在非治愈性治疗后再生长是因为有些恶性干细胞未被杀灭。为了弄清还有多少干细胞未被杀灭，需建立能从肿瘤内取出的细胞中识别出干细胞的分析方法。这方法一般是检测干细胞的形成集落能力。这些细胞称为“克隆源性”或“集落形成”细胞。(二)克隆源性细胞：在特定的生长环境内有能力形成含有超过50个细胞集落的细胞。以这个分裂能力作为标准来衡量细胞的繁殖能力。二、放射线对细胞杀灭机制(一)DNA损伤和细胞杀灭：DNA是放射线作用于细胞的最重要的靶。1．辐射损伤的初始过程：在一个治疗剂量的照射后所产生的电离数量是非常大的，每个细胞照射lGy有大约105的电离。照射lGy粗略地计算可在每个细胞内造成一个致死损伤。•大部分的电离不起作用是由于以下因素：自由基的清除、接近DNA的电离数量很少不足以造成它们的损伤以及细胞的修复。2．放射线对DNA的损伤：辐射所致DNA损伤主要是DNA链的断裂。其有两种类型的链断裂：单链断裂和双链断裂(两条互补链的断裂之间的距离不大于4个碱基对)。DNA损伤是射线杀灭细胞和导致细胞突变的关键。3．DNA链断裂的分子机制：链断裂的形成可以直接由于脱氧戊糖破坏或磷酸二酯键的断裂，也可以间接通过碱基的破坏或脱落所致。(1)脱氧戊糖和磷酸二酯键的破坏：水辐射产物，水合电子(e—水合，或e—qq)羟自由基OH和氢自由基H·可以分别作用于碱基双键上，其中以羟自由基破坏性最强。由于羟自由基的高反应性，能从糖基上抽去20％的氢，因此DNA键的断裂主要与羟自由基作用有关。(2)碱基损伤：碱基损伤可引起DNA双螺旋的局部变性，特异的核酸内切酶能识别和切割这种损伤，并经过酶的作用，产生链断裂。嘧啶碱受辐射损伤后较易脱落。4．电离辐射引起DNA链断裂的重要特点(1)单链断裂(SSB)可由一个自由基攻击而产生，而双链断裂(DSB)须由两个自由基引起。(2)辐射所引起的DNA内的损伤数比那些最后导致细胞死亡的损伤数要大得多。一个可导致平均每个细胞有一次致死事件的照射剂量将杀死63％的细胞，而剩下的37％还是有活性的。这个剂量被称为平均致死剂量(Do)。MicrobeamAlphaHitsforCellTransformationEachcellhitbyoneparticleAverageofoneparticle/cellMilleretal.1999实验发现细胞死亡的发生和射线所致的SSB数量没有相关性，但和产生的DSB数量有较好的相关性。可见DSB是辐射致死细胞的关键损伤。(三)细胞死亡：两种形式存在增殖性细胞死亡间期性细胞死亡增殖性细胞死亡•是指细胞受照射后一段时间内，仍继续保持形态的完整，甚至还保持代谢的功能，直至几个细胞周期以后才死亡。•这是最常见的细胞死亡形式。间期性细胞死亡•细胞死亡与细胞周期无关•死亡一般发生在照射后几小时内•以细胞凋亡的形式出现。•最典型的间期死亡是淋巴瘤细胞的死亡。在临床上看到唾液腺经照射后很快出现口腔干燥的感觉，为什么？唾液腺的浆细胞的放射生物效应是细胞凋亡•两种死亡都依赖于照射剂量•前者与剂量呈指数性关系•细胞凋亡在剂量1.5-5Gy范围内较敏感及照射后数小时内即可发生。指数关系的特点：增加一定剂量就有一定比例的细胞而不是数量的细胞被杀死第四节细胞存活曲线细胞存活曲线是定量描述辐射吸收剂量与细胞存活之间关系的曲线。在放疗后的病理切片中，发现有形态完整的肿瘤细胞有意义吗？一、细胞存活的概念和存活曲线的绘制(一)细胞存活的概念对于有增殖能力的细胞，如造血细胞、离体培养细胞、肿瘤细胞等，凡是保留其增殖能力，能无限产生子代的细胞，称之为存活细胞。临床放射生物学对肿瘤细胞存活可定义为:经放射线作用后细胞仍具有无限增殖能力的细胞。相反，细胞在照射后已失去无限增殖能力，即便其形态仍保持完整，有能力制造蛋白质，有能力合成DNA，甚至还能再经过一次或两次有丝分裂，产生一些子细胞，但最终不能继续传代者称为已“死亡”细胞。按照细胞存活定义，放射治疗效果主要是根据是否残留有无限增殖能力的细胞，而不是要求瘤体内的细胞达到全部破坏。因此，在放疗后的病理切片中，发现有形态完整的肿瘤细胞有意义吗？不一定证明是有临床意义的肿瘤残留。(二)细胞存活曲线的绘制细胞存活曲线的绘制方法主要依靠细胞培养，以制成单个细胞接种平面，用不同剂量照射，得到的集落形成数与未经照射的对照组进行比较，得出存活率。根据不同剂量的不同存活率制成的曲线即为细胞存活曲线。集落形成实验取指数生长期细胞，0.25%胰酶消化成单细胞悬液；梯度倍数稀释将102~105个细胞种植到直径6cm的培养皿中，辐射剂量分别为0Gy，0.5Gy，1Gy，2Gy，4Gy，6Gy，8Gy(由小到大的放射剂量）体外培养37℃，5%CO2条件下培养10-14天后，细胞克隆形成；弃培养液，甲醇固定15min，姬姆萨应用液染色20min；流水冲洗染色液，空气干燥；计数每个培养皿中的集落数，以50个细胞数作为一个集落，计算每组均值。计算存活率例如：•平皿A种植100个细胞。共形成70个集落，集落形成率（PE）是70%。平皿B是接种2000个细胞，照射8GyX线后长成32个。•存活率=照射后细胞形成的集落数/接种细胞数×未照射细胞集落形成率（PE）•8Gy照射细胞的存活率为？A.未照射平皿的集落生长B.照射8GyX线后的集落生长32/2000×70%≈0.023以不同的剂量照射细胞，得到各剂量组的细胞存活率，以剂量为横坐标，存活率为纵坐标，绘制细胞存活曲线。X射线•对于低能中子或α射线，存活曲线是直线，特点：只要一个生物学参数，即37%剂量斜率或D0值（斜率的倒数）。•但对于X线、γ线，它们的细胞存活曲线有一个初始肩区，随后是直线部分。•特点：有多个生物学参数：D0值、外推值n、准阈剂量Dq二、细胞存活曲线的参数及其临床意义临床放射生物学中细胞存活曲线主要指非指数存活曲线，即有“肩段”的存活曲线，在此曲线中存在几个参数(图1)，各个参数分别代表不同的生物