临床生物化学和生物化学检验06

第六章诊断酶学P136-176蚌埠医学院生化与分子生物学教研室2教学目标[教学时数]6学时[掌握]血清酶的分类、生理变异、病生机制等，同工酶及其亚型测定，临床诊断中常用的血清酶及其同工酶，重要血清酶的测定、原理及评价。[熟悉]酶的有关酶基本知识，酶活性浓度的测定技术及酶的免疫化学测定。3第一节血清酶4一、血清酶的来源根据酶的来源及其在血浆中发挥催化功能的情况，将其分为：P143一般代谢酶组织专一酶血浆特异酶非血浆特异酶外分泌酶细胞酶一般代谢酶组织专一酶血浆特异酶非血浆特异酶外分泌酶细胞酶血清酶5名称血浆特异酶非血浆特异酶外分泌酶细胞酶一般代谢酶组织专一酶来源肝消化腺或其它外分泌腺各组织器官（无器官专一性）肝（有器官专一性）种类凝血酶原、Ⅹ因子、Ⅻ因子、纤溶酶原、ChE、CER、LCAT、脂蛋白脂肪酶等胰淀粉酶、胰脂肪酶、胰蛋白酶、ACP、ALP等LDH、AST、ALT、CK、MDH等OCT等6二、血清酶的去路酶蛋白在血管内的失活与降解（主要代谢去路）血清酶的半寿期（T1/2)：酶失活至原来活性一半所需时间。有助于了解同一疾病不同酶升高持续时间的差异。肝或网状内皮系统对血清酶的清除少数以酶原形式存在的血清酶类（凝血酶原、纤溶酶原）在活化后迅速被肝清除，网状内皮系统也可能参与血清酶（LD、AST、AMY、CK等）的清除。血清酶的排泄尿路是血清中低分子量酶的重要排泄途径，如胃蛋白酶原、淀粉酶（AMY）。转入其它体液只有血清酶的来源与去路保持平衡，才能维持酶活性保持相对恒定。但一些病理情况往往促使这种平衡被打破，导致血清酶活性的变化。P1437三、血清酶变化的病理机制（一）合成异常合成减少合成增多肝损害导致合成酶的能力受损（ChE、LCAT）酶基因变异引起酶合成减少（铜氧化酶）增生性疾病（骨骼疾病，ALP)恶性肿瘤（前列腺癌，ACP)酶的诱导作用（乙醇，γ-GT）P1448（二）释放增加（大多数血清酶增高的主要机制）细胞内外酶浓度的差异对于非血浆特异酶，细胞内外浓度差可在千倍以上，只要有少量细胞坏死或病变，血中酶浓度明显升高。对血浆特异酶，细胞病变很少引起血中酶浓度明显升高。酶的相对分子量（影响细胞内释出的关键）酶从细胞内释出的速度与酶的相对分子量成反比。如AMI时，血中最先升高的是CK（MW：85kD)，LD（MW：125kD)出现升高明显延迟。酶的组织分布含酶量高且血流丰富的组织器官，其细胞内酶进入血流的可能性大；除少数组织专一性酶以外，大多数血清酶不能特异反映某个特定组织的病变。但同工酶的发现大大提高酶检测的组织的特异性。酶在细胞内的定位及存在形式线粒体酶不易从细胞中释出，如ASTm的检测往往反映肝细胞的损伤程度，且是AMI中最后升高的酶，用于判断预后；有些酶在细胞内与结构蛋白结合，较难释放。ATPATP不足，细胞内酶容易释放。P1459（三）排出异常肾功能减退，血清AMY活性升高可能因酶排泄障碍而在血液中滞留。胆道梗阻，血清ALP升高的原因是梗阻区ALP合成加强，ALP排泄受阻而逆流入血。大多数酶，不存在以上的清除机制。P14510四、血清酶的生理差异（一）性别多数酶无差异，少数有差异男性高于女性：CK、ALP、γ-GT女性高于男性：LDH1（青年妇女）（二）年龄最明显的例子是ALP，新生儿血清中ALP略高于成人，1～5岁增至成人的2～3倍，然后逐渐下降，到10～15岁，ALP又明显升高，可达成人的3～5倍，20岁后降至成人值。（三）饮食血清中大多数酶不受进食影响，故测定酶活性不一定需要空腹采血。（四）运动激烈的肌肉运动可使血清中多种酶，如CK、LD、AST、ALD、ALT等活性升高。（五）妊娠（六）其它P14511第二节酶活性浓度的测定技术P146-P16012酶活性浓度的测定技术酶活性浓度概念酶活性浓度测定连续监测法检测酶活性浓度工具酶血清酶活性浓度测定条件的优化酶活性浓度的单位13一、酶活性浓度的概念1.酶的特性：微量性、高效性等。直接测量非常困难（mmol/L或mg/dl）通过测定被加速化学反应的反应速率，来间接反映酶的浓度2.酶促反应SSEE+ESEPE+PV＝dsdt或V＝dpdtES143.酶活性浓度即酶所催化的化学反应的反应速率，用酶促反应中单位时间内底物的减少量或产物的生成量来计算。注意：只有当酶所催化的反应速度仅与[E]成正比，而不受其它因素影响时，即在酶促反应的零级期，才能根据酶所催化的化学反应速率来确切表示酶活性浓度的大小。P14615实际上是通过检测酶活性浓度间接反映酶的量，因为直接检测酶的质量浓度要求的实验条件及技术条件非常高，价格昂贵，不适用于临床检测，因此测定酶活性浓度是临床酶学分析最为常见的方法，具有迅速、灵敏、成本低等特点。但仅在上述前提下，只能在反应的零级期，即只有在酶促反应的最适条件下，才能真实地代表酶含量。因此可根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行酶活性浓度的检测。16零级一级[P][S]V＝dpdt反应级数时间4.酶促反应进程延滞期线性期非线性期P147LagphaseZeroorderLinearphaseFirstorder酶促反应时间进程曲线17单试剂测定体系酶促反应进程曲线P14818结论：为了计算酶活性浓度，必须根据线性反应期（零级反应期）的反应速率才能准确计算出酶活性浓度否则将导致误差。酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度达到Vmax，即在过量底物存在下的零级反应期的V，此时V与[E]之间有线性关系。P14819二、酶活性浓度测定方法（一）按检测方法分类1、量气法其原理是通过测量一封闭反应系统中气体变化后的气体体积或压力，从而计算出气体的变化量适用于测定在反应中产生或消耗气体的酶2、分光光度法酶促反应的底物与产物结构不同，光吸收谱也有差异，不仅能在可见光范围测定有色溶液的浓度，还能在紫外光波长范围测定特异的带有双键或环状结构的无色物质3、荧光法和放射性核素法通过荧光光度计测定酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比4、其它方法P14620（二）按反应时间分类1、定时法（取样法、终点法、两点法）优点：简单，测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择不考虑对酶活性的影响。缺点：无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反应。注意：应先做预实验找出酶促反应速率恒定的时期，确定线性时间；保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要精确。P14821定时法，早期测定酶活性浓度的方法，大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应的平均速度。连续监测法，即指连续测定酶促反应过程中某一产物或底物浓度随时间变化的多点数据，求出酶促反应初速度，间接计算出酶活性浓度的方法。其是临床测定酶活性浓度最常用方法。222、连续监测法（动力学法、速率法）优点：容易找到直线区域，选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应。缺点：线性反应期因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定，必须选取酶促反应的最适反应条件，需要有可以连续监测的设备。P1493、平衡法目前临床应用较少，通过测定酶促反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法。23三、连续监测法测定酶活性浓度（一）种类1.直接法不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化性质的变化（如：A、荧光、旋光性，pH、电导率、粘度等），从而计算出酶活性浓度。评价方法简单，但只有底物与产物之间，在理化性质方面有显著性差异时，才能使用直接法，只有很少一部分酶能用直接法测定。P14924（1）目前以分光光度法最为广泛，利用340nm处吸光度的变化测定各种脱氢酶。NAD(P)++H+NAD(P)H仅在260nm处有吸收峰在260、340nm处有吸收峰340nm处A的变化可以反映反应体系中NAD(P)H量的增减，进而反映酶活性浓度。（2）利用一类人工合成的所谓色原性底物，其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物。P14925（1）在原反应体系中加入一些试剂，其只和酶反应物迅速作用，产生可被检出的物质，但该试剂不和酶反应，也不影响酶的活性。SPE+试剂可被检出的物质（2）酶偶联法目前应用最多，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。P14926（二）酶偶联反应反应模式ABPExEi被测酶被测酶始发反应始发反应指示反应指示酶指示反应指示酶ABCPExEaEi辅助酶辅助反应酶偶联体系辅助酶辅助反应P149271.酶偶联反应时相酶偶联反应一开始不能反映酶活性，在反应中存在几个时相。以临床常规酶学分析中常见的ALT的检测为例，在该酶偶联体系中的指示酶为脱氢酶，反应原理如下：L-丙氨酸＋α-酮戊二酸α-丙酮酸＋L-谷氨酸α-丙酮酸＋NADH乳酸＋NAD+ALTLDH此时反应的方向由NADH转变为NAD，随反应进行，A应随之而下降，通过检测反应产物A在340nm处A的变化速率，可以检测指示酶反应。P150ALT双试剂法测定中，首先使血清与缺少α-酮戊二酸的底物溶液混合，37°C保温5m，将样品中所含的内源性α-酮酸消耗完。然后再加入α-酮戊二酸启动ALT催化的反应。28反应一开始加入的试剂1中只有丙氨酸，不存在α-酮戊二酸，在此时相中，存在于样品中的干扰物质（内源性α-酮酸）消耗完。加入试剂2（即α-酮戊二酸）启动反应，在初始阶段，产物α-丙酮酸开始出现，并逐渐增多，但处于较低水平，指示酶反应速度也较低，不能代表待测酶的Vx。随着产物α-丙酮酸增加到一定程度，Ex和Ei反应V相同，达到稳态期。此阶段340nm处A出现明显的线性变化。最后由于底物的消耗，反应V逐渐减慢，偏离线性。P150292.酶偶联反应注意事项(1)延滞期应越短越好，测定时间要避开此期。(2)不是所有的酶都适合用酶偶联法进行测定，酶偶联反应V应超过或等于Vx，Ei反应必须是一级反应，即指示酶反应速率和测定酶的产物B浓度成正比。只有使用大量的Ei及其Km值很小时才能做到。(3)从经济方面考虑应选用一些来源容易且价格便宜的酶（指示酶）制剂。(4)适当的指示酶的用量，反复实验法确定，即做到酶偶联速率不随酶量的增加而升高，并在所选的最适条件下，指示酶偶联反应速率和酶活性浓度成正比。P15030（三）干扰因素(1)其他酶和物质的干扰(2)酶的污染(3)非酶反应(4)分析容器的污染(5)沉淀形成解决方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正，另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。P15131四、工具酶工具酶：酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶。指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。（一）工具酶（二）常用工具酶常用工具酶多为氧化还原酶类工具酶纯度不必要求过高工具酶中杂质的含量有一定的限制P15232（三）工具酶参与的指示反应临床生化检验中，很多项目的测定往往使用有工具酶参与的类似的反应原理－－共通（通用）反应途径。1.偶联H2O2的工具酶及其指示反应葡萄糖尿酸胆固醇甘油丙酮酸葡萄糖氧化酶尿酸氧化酶胆固醇氧化酶甘油氧化酶丙酮酸氧化酶H2O2以H（e）为受体的指示酶以NAD(P)H为辅酶参与的指示酶触酶POD(最常用）P1522H2O2+4-AAP+酚醌亚胺(红色)+4H2OPOD33例：葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖Glu＋O2＋H2OGA＋H2O2H2O2＋4-AAP＋酚H2O＋O2＋红色醌类化合物GODPOD葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）利用O2和H2O将Glu氧化成GA，并释放H2O2，过氧化物酶（peroxidase，POD）在色原性氧受体存在时将H2O2分解为H2O和O2，并将色原性氧受体4-AAP和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder反应。红色醌类化合物的量与Glu含量成正比。即POD催化下，H2O2氧化芳香族胺色素原生成有色色素，此类色素原供氢体包括：OT、DAB、ODA、TMB。342.NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应许多氧化