全内反射荧光显微术及其在生物单分子科学中的应用1全内反射的

全内反射荧光显微术及其在生物单分子科学中的应用北京大学力学与工程科学系生物医学工程专业02级博士钟建学号：10203829摘要：全内反射荧光显微技术利用全内反射产生的隐失波激发样品，由于隐失波强度成指数衰减，使激发区域限定在样品表面的一薄层范围内，因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比。它是当今世界上研究单分子科学最具前途的新型生物光学显微技术之一，可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。近年来，已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。本文主要介绍了全内反射荧光显微技术的基本知识及其在生物单分子科学上的应用。关键词：全内反射荧光显微技术，生物单分子，隐失波生物单分子研究是指在单分子水平上对生物分子行为（包括构象变化、相互识别、相互作用等）的实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵和调控等，籍此深入阐明构效、构性关系。生物单分子研究已经成为21世纪生命科学领域的一个重点研究方向。在生命科学领域有着广泛的研究前景。生物单分子研究要求发展超高分辨率的成像技术，从而在分子尺度上探测生命活动的细节。新一代光学显微技术以其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性，成为生物学家和物理学家的研究热点。目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术，近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。这些技术在分子生物学、分子化学、激光医学及纳米材料等领域受到广泛关注，并产生了深远的影响。其中，全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术，它利用全内反射产生的隐失场来照明样品，从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发，荧光成像的信噪比很高。这种方法的成像装置简单，极易和其它成像技术、探测技术相结合。目前已成功的实现200ｎｍ甚至更低的空间分辨率。因此被生物物理学家用来观察单分子成像，也被细胞生物学家和神经科学家来观测发生在细胞膜上的生理反应[2]。1.全内反射的基本理论全内反射是一种普遍存在的光学现象。考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射，另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满足关系式n1sinθ1=n2sinθ2(1)若n1大于n2，例如折射率为θ1的是玻璃，折射率为n2的是液体溶液。当入射角增大，增大到临界角θc时，这时的透射角为90°，当入射角大于或者等于临界角时，光不再透射进溶液，也就是发生了全反射，如图1所示。由snell定律可知θ2=90°θc=sin-1(n2/n1)(2)由上式可知，当n1大于n2时，全反射就可能发生。如果玻璃的折射率取为1.52，溶液的折射率取为1.33(生物细胞的折射率范围是1.33～1.38)，则玻璃/界面处的临界角为61.74°。从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中，是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，而振幅随离界面的距离ｚ作指数衰减。可以看出，透射电磁场的振幅随进入样品的深度ｚ减小得非常快，这种电磁场只存在于界面附近一薄层内，因此，我们称此非均匀场为隐失场，。其在第二介质中的有效进入深度约为一个波长[3]。隐失波激发在一个波长范围之内的荧光分子发出荧光（如图1）。图1左图为全内反射示意图。箭头表示激光的方向，激光被全反射，同时产生在z方向成指数衰减的隐失波。黄色小圆点表示被隐失波激发的荧光分子，白色小圆点表示未被激发的荧光分子。右图表示隐失波的强度-深度图。2.全内反射的仪器组成到目前为止，已经发展了多种全内反射荧光显微镜成像系统。其中最为普遍的有两种类型：棱镜型和物镜型[2]。如图2。图2两种类型的全内反射荧光显微镜成像系统，1）为棱镜型，2）为物镜型。棱镜型成像系统只需要显微镜，棱镜和激光光源，所以容易实现。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所以样品大小和样品的放置受到限制。而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。3.物镜型光学成像系统中物镜由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值孔径（NA）必须大于1.38。表达式为NA=nsinθ;nsinθnsinθc(3)其中NA为物镜的数值孔径，n,θ分别为物镜的折射率（浸没油）和孔径角。θc为发生全内反射的临界角。当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围（最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.65-1.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大，降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型全内反射荧光成像系统的关键[2，4]。表1：全内反射角和最大的物镜角4.生物单分子荧光探测真正意义上的单分子荧光探测，有很多的困难，但是还是可能的。单分子荧光探测主要有三个问题：（1）单分子发出的荧光信号通常是很微弱的，所以要寻找一个足够灵敏的探测器。（2）由于拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光，极大的干扰了信号光的探测。所以应该尽量降低背景激发光。（3）本体溶液产生的焦点荧光之外的背景光。这些问题都可以利用全内反射荧光显微成像系统来解决[5]。近年来,超灵敏的探测设备的飞速发展，为在最普适的生理状况下实现生物单分子的荧光探测铺平了道路，解决了问题（1）。超灵敏的探测设备如单光子计数的雪崩光电二极管，可以达到5%的探测效率，即100个光子中有5个光子可被探测到。这样，从单个典型的荧光团的光发射中可以探测到约5000～50,000个光子。这个数目不仅对实现单分子探测是足够的，对光谱识别和一定时域内的实时监控也是足够的。对于包含单个的荧光团如荧光素、若丹明或蓝色素的分子来说，这种估算是严格的。而对于生物大分子而言，如蛋白质和核酸，为了加强信号的强度，每一个分子要用很多个相同的荧光团来标记[4]。还有当今最灵敏的成像探测器电子倍增电荷偶联设备（ElectronMultiplyingChargeCoupledDevice），它的优点主要在降低了噪声读取基底，高的量子效率（可以达到90%以上），最少的暴光时间，降低了激发所需的强度，降低了荧光团浓度，增加了放大倍数。无可比拟的信噪比。因此是最先进的用来做单光子检测的科学CCD照相机[6]。全内反射显微成像是采用隐失波照明。隐失波在平行界面方向以行波场方式传播,在垂直界面方向则是一个指数衰减场。所以这种显微成像技术成像的视野开阔，同时探测样品的厚度却很薄，约为百纳米量级，从而解决了问题（2）和（3），可以将拉曼散射，瑞利散射和杂质荧光等产生的背景光减小到极低的水平，也使得在百纳米量级范围以外的本体溶液因为没有激发而得已解决。5.在生物单分子研究中的应用细胞内的很多至关重要的生命活动过程如信号转导，蛋白质转运，病原体侵入均与细胞表面有关，如果我们可以直接对这些细胞表面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深层区域信号的干扰，这对细胞生物学研究来说，将是具有重大意义的突破。全内反射荧光显微术正是凭借其独特的优势,它的荧光激发深度只在～200ｎｍ的薄层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成像技术[7]。如图3。现在全内反射荧光显微术已被广泛用于实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动、单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移(ＦＲＥＴ)、ＡＴＰ酶的翻转[8,9]，聚合物内单个分子的结构变化[10,11]，等离子体膜附近的神经分泌腺的颗粒运动[12]，胞内吞和胞吐[13，14]等多方面。图3利用物镜型全内反射荧光显微镜观察活细胞表面示意图。6.与其他生物单分子研究技术的比较图4活细胞单分子显微镜方法比较。以活细胞研究为例，全内反射荧光显微镜与其他单分子技术相互补充，从不同的角度研究细胞[15]，如图4。单粒子追踪术（SPT），单染色示踪术（SDT），扫描近场光学显微镜（SNOM），原子力显微镜（AFM）和分子识别力显微镜（MRFM）都是研究放置在固体平面支撑物上活细胞的上表面细胞膜的技术，SPT和SDT是都是成像技术，SPT利用胶体金粒子来标记细胞表面分子，从而在纳米精度和毫秒尺度上追踪细胞表面分子的运动。SDT利用荧光分子来标记细胞表面分子，利用荧光分子来观察。SNOM具有较高的侧向分辨率，而在细胞表面，分辨率显著的降低，而且由于其较长的成像获取时间而不能用于对运动的结构成像，AFM与SNOM具有相似的高的侧向分辨率，细胞表面成像是分辨率显著的降低，也不能对运动的结构成像，MRFM是在AFM的基础上，对AFM针尖进行修饰,利用生物素-抗生物素蛋白，细胞黏附蛋白，抗体-抗原之间的相互作用来研究细胞表面的一些性质的一种技术。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和双光子激光扫描显微镜（TPLSM）则是可以检测细胞质内荧光的技术，CLSM的重要优势在于，它提供了仅从单光学薄层收集光波的可能性。与聚焦平面共轭的针孔定位（即共焦）可避免来自检测器之外的光，即从聚焦平面以外的其它地方反射/发射过来的光。但是这个光学薄层的厚度大约为500-800nm，要大于全内反射荧光显微镜的光学薄层的厚度（200nm），而且其较长的成像获取时间使得在毫秒尺度上进行的组成型改变和动力学重排研究成为不可能。TPLSM对生物系统和体内细胞性质具有高的分辨率，如细胞器，细胞连接，细胞内钙离子浓度，细胞膜流动性。全内反射荧光显微镜（TIRFM）则是研究紧贴固体平面支撑物的细胞膜的技术，但是正因为膜与固体支撑物具有相互作用，以及隐失波强度的指数性下降而导致单分子信号的指数性下降，使得对结果的解释具有一定的困难性。因此将全内反射荧光显微术与其它的显微成像技术相结合来研究将是未来发展的一个新的方向。全内反射荧光显微术在短短的十几年中发展十分迅猛，已经成为生物单分子科学研究必备的工具之一，它将成为细胞-基底接触区域内的丰富的细胞生命活动最强有力的探测方法。如细胞膜内蛋白质的动力学过程，基底附近的细胞骨架，细胞运动等。在未来的一段时间内，全内反射荧光显微术将会主要从两个角度去改进：光电探测设备探测效率和探测速度的提高以及单分子染色技术的发展。参考文献：[1]ShumingNie,RichardN.Zare.Opticaldetectionofsinglemolecule.AnnuRevBiophysBiomolStruct,1997,26:567-596.[2]YoshihiroKawanoandReinhardG.Enders.Totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy.ApplicationNote,1999December:28-30.[3]王琛，袁景和，王桂英，徐至展。入射光的偏振特性对全内反射荧光显微术中荧光激发的影响。物理学报，2003，52：3014-3016.[4]王琛，王桂英，徐至展。全内反射荧光显微术。物理学进展，2002，22：406-415.[5]G.I.Mashanov,D.Tacon,A.E.Knight,etal.Visualizingsinglemoleculesinsidelivingcellsusingtotalinternalreflectionfluorescencemicroscopy.Method,2003,29:142-152.[6][7]YasushiSakoand