[免疫学]实验2.

实验二一、凝集反应二、沉淀反应三、免疫血清的制备（2）：家兔心脏采血目的要求（一）掌握凝集反应、沉淀反应原理、方法及用途。（二）熟悉实验的操作手法。一、凝集反应定义：颗粒性抗原（病原微生物或红细胞）与相应的抗体特异性结合，在电解质存在的条件下，如果两者比例适当，在一定的温度下经过一定的时间，可以形成肉眼可见的凝集块，这种现象叫做凝集反应。分类：直接凝集反应间接凝集反应间接凝集抑制反应直接凝集反应细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原在适当电解质存在的条件下，可以直接与相应的抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。玻片凝集：•细菌鉴定•ABO血型鉴定1、细菌鉴定原理：将已知抗体直接与未知的颗粒性抗原物质（细菌）混合，在有电解质存在的条件下，如两者对应则发生特异性结合，而形成肉眼可见的凝集物，即为阳性；如两者不对应便无凝集物出现，即为阴性。此法属定性试验，主要用于细菌鉴定和分型等。1、1:10稀释的伤寒杆菌诊断血清、生理盐水；2、菌种：伤寒杆菌、大肠杆菌菌液3、洁净载玻片、记号笔、试管架等。实验材料实验流程123NS1滴伤寒诊断血清1滴伤寒杆菌菌液大肠杆菌菌液注意事项：1、非实验物品放入抽屉以防污染；2、玻片平端，谨防菌液污染阴性阳性结果观察ABO血型系统2、ABO血型鉴定原理：人类ABO血型抗原分A、B两种。A型血者红细胞膜上有A抗原，B型血者红细胞膜上有B抗原，AB型有A、B两种抗原，O型则不含A、B抗原。用已知的抗A或抗B抗体与受检者红细胞混合，抗A和或抗B抗体与红细胞表面上的相应抗原结合而引起红细胞凝集，根据其凝集状况判定受试者的血型。1、抗A及抗B抗体、生理盐水；2、玻片、采血针、试管、滴管、消毒棉棒、牙签、记号笔等。实验材料AB抗B1滴抗A1滴NS10滴血1滴红细胞悬液红细胞悬液1-2滴注意事项1.消毒处干燥后再取血2.滴管不可与抗体液面接触3.牙签不可混用步骤结果观察A型B型AB型O型抗A抗B二、沉淀反应原理可溶性抗原（多糖、蛋白质、类脂等）与相应抗体特异性结合，两者比例适当并有电解质存在及一定温度的条件下，经过一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀物。•环状沉淀•免疫扩散技术：单向免疫扩散、双向免疫扩散•电泳技术：对流免疫电泳、免疫电泳、火箭免疫电泳沉淀反应可在液体中进行，如环状沉淀。沉淀反应大多用半固体琼脂凝胶为介质进行琼脂扩散或称免疫扩散。1、环状沉淀反应将少量高浓度的抗体置于小试管底层，再将抗原沿管壁徐徐加入，使之重叠于抗体的上面，室温下静置数分钟，可以看到在抗原与抗体的接触面形成白色沉淀环。此试验常用于抗原的定性试验。实验器材免疫血清（抗体）抗原小沉淀管、毛细吸管、生理盐水。阳性阴性抗原抗体NS抗体将2只沉淀管分别标明1、2。每只试管加入1/3高度抗体。1管加入等量抗原，2管加入等量NS。静置5mins，观察结果。实验流程注意事项1.加样时将沉淀管倾斜约45°2.缓慢加样，不可破坏两液体之间的液面将某种特异性抗体混合于琼脂中，再于其上打孔，将一定量的抗原加入孔中。抗体不会再扩散，孔中抗原向四周呈辐射状扩散。如抗原与已知的抗体相对应，在两者比例适合处即出现由IC所形成的沉淀环，直径大小与抗原浓度成正比。2、单向免疫扩散（示教）定性和定量可溶性抗原与抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，两者各自向四周扩散，若抗原与抗体相对应，两者相遇即发生特异性结合，并在比例合适处形成白色沉淀线。3、双向免疫扩散（示教）抗体抗原此试验可用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体）。1、1.2％生理盐水琼脂。2、待检抗原血清、肝癌病人AFP阳性血清。3、AFP诊断血清（含AFP抗体）。4、载玻片、琼脂板、打孔器、微量加样器、吸管等。实验器材（1）孔：抗体（AFP诊断血清）；（2）1、4孔：阳性对照（AFP阳性血清）；2、3、5、6孔为待检抗原；（3）琼脂板放入湿盒内，24h后检查结果。14236524h142365•实验步骤原理带电的胶体颗粒在电场中移动的方向与其所带电荷有关。抗原在pH8.6的缓冲液中带负电荷，由阴极向阳极移动。抗体为球蛋白，只带微弱的负电荷，分子量又大，因为电渗作用反而向负极倒退。当抗原与抗体在琼脂两孔间相遇时，在两者比例适当处形成白色沉淀线。4、对流免疫电泳实验（在双向扩散基础上加电泳的方法）由于抗原、抗体在电场中定向移动，被限制了多方向自由扩散的倾向，因而提高了实验敏感度。而且，沉淀线出现较快，可在1小时之内观察结果，所以可用于快速诊断。材料1、抗AFP血清，已知AFP阳性血清，待检血清。2、微量加样器、打孔器、电泳仪等。实验步骤1、制备琼脂板，按照模板打孔2、加样：分别向1、3孔内加入抗AFP血清；向2孔内加肝癌病人AFP阳性血清作为阳性对照，4孔内加待检病人血清。3、通电：将琼脂板置于电泳槽内，抗原端放阴极侧，抗体放阳极侧，固定电压5~6v/cm，通电45min左右。＋－抗AFP血清待检血清已知阳性血清抗AFP血清13241324注意事项1.打孔时将孔内琼脂全部吸出、尽量不破坏孔边缘琼脂2.加样时不可溢出或加入气泡，不可将琼脂吹起3.电泳时分清正、负极（试验完毕请将琼脂弃入垃圾袋）1324结果观察：?三、免疫血清的制备（2）：家兔心脏采血原理：将适当的抗原物质注入动物体内，经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体，这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清。取羊红细胞免疫家兔一只，心脏采血，分离血清，血清中含有特异性抗体（抗羊红细胞抗体）。实验材料免疫家兔；消毒棉球、注射器、试管、离心机等。固定家兔，用碘酒、酒精棉球消毒心前区皮肤。在胸骨左缘外侧1-2cm左右、3-4肋间，选择心跳最明显处进针。（注射部位正确时，血液会自动涌入针管）体重2kg左右的家兔，每次抽血一般不超过4-5ml，收集血液于无菌试管中。放在试管架上，凝固4-5h后，离心，收集血清。实验步骤：注意事项：取血部位要准确，不要划破家兔心脏，尽量不令动物死亡；见到回血再取血；向试管中注射血液时要将针头取下。小结抗原抗体检测：特异性、可见性凝集反应:颗粒性抗原直接凝集反应玻片凝集----定性沉淀反应：可溶性抗原定性：环状沉淀、双扩、对流免疫电泳实验报告1.细菌鉴定的原理、步骤、结果和分析，2.ABO血型鉴定的原理、步骤、结果和分析3.对流免疫电泳的原理、步骤、结果和分析，下次试验内容：补体参与的反应：（*免疫血清制备与应用之3）补体的溶血反应；补体结合实验T细胞数量的测定:E花环形成实验T细胞功能测定：淋巴细胞转化试验T亚群的测定