分子生物学检查

分子生物学检查南京中医药大学西内教研室徐庆分子生物学定义分子生物学（molecularbiology)是从分子水平研究生命现象的科学。它的核心内容是通过生物的物质基础—核酸、蛋白质、酶等生物大分子的结构、功能及其相互作用等运动规律的研究来阐明生命分子基础，从而探索生命奥秘分子生物学发展简史1871年Miesscher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离到DNA1953年Watson和Ｃrick阐明DNA双螺旋结构1958年Meselson和Stahl提出DNA半保留复制模型1965年发现质粒1966年Nirenberg等破译全部遗传密码1970年Smith分离到第一种核酸内切限制酶1973年Boyer和Cohen建立DNA重组技术1977年Sanger以及Maxam和Gilbert发明快速DNA测序技术1981年Palmiter和Brinster成功获得第一只基因小鼠1985年PCR方法问世；Watson出任“人类基因组计划”首席科学家1990年美国批准第一个体细胞基因治疗方案分子生物学发展简史1995年英国“自然”杂志发表人类基因组全物理图1997年英国爱丁堡罗斯林研究所培养出第一只克隆羊多莉1999年中国正式加入“人类基因组计划（HGP）”2000年全部人类基因组测序工作宣告完成，进入后基因组计划时代(基因克隆计划、基因组多样性计划、cDNA计划、蛋白质计划、细胞计划）分子生物学与现代医学一、分子生物学在发病机制中的应用1阿尔兹海默病（AD）的基因定位2生物活性多肽及蛋白质mRNA研究确证肾素血管紧张素系统在遗传性高血压发病中起重要作用3对某些病毒致病作用的研究发现肝癌细胞DNA整合有HBV-DNA，认为乙肝与肝癌发病密切相关4认识了某些遗传疾病的发病机制地中海贫血是或基因缺失或点突变所致二、分子生物学在疾病诊断中的作用发病过程：基因突变---mRNA---蛋白质（激素）---细胞病变---组织器官病变---临床症状根据基因突变检测、基因连续性分析、mRNA检测三种途径，使用核酸分子杂交和PCR技术，进行分子生物学检查，使遗传性疾病、感染性疾病和肿瘤等的诊断提前到基因和mRNA水平三、分子生物学在疾病治疗中的应用基因治疗：将目的基因加以修饰，转移到体细胞中，以达到治疗作用应用：单基因遗传病、肿瘤、心血管、自身免疫疾病及病毒感染等危害较大且目前无有效治疗途径的疾病四、重组DNA技术与新药研究重组微生物、基因疫苗、细胞因子合成、转基因动植物等分子生物学的一般原理和研究方法一、核酸的结构和功能1核酸的一级结构：磷酸二酯键连接成的核苷酸链核苷酸：戊糖、磷酸基团、碱基碱基：DNA：A、G、T、CRNA：A、G、U、C核酸是极性分子，5’端为磷酸基团，3’端为羟基，核酸序列的习惯写法是5’端3’端核酸的结构和功能2DNA的二级结构：著名的双螺旋结构两条核苷酸链通过碱基间氢键相连（A—T，C—G），走向相反。DNA的变性与复性：诱导因素：加热、酸、碱、乙醇、丙酮、高盐等应用：分子杂交的基础核酸的结构和功能3DNA的三级结构：DNA双螺旋和核小体串珠装状的核小体压缩成螺旋形，进一步折叠成染色单体，DNA长度因此缩短10000倍4DNA功能携带和传递遗传信息，体现遗传过程的相对保守性遗传的中心法则DNARNA蛋白质复制转录逆转录复制（病毒）翻译核酸的结构和功能5DNA的半保留复制原则核酸的结构和功能6RNA：rRNA：组成核糖体mRNA：传递遗传信息由核内至胞浆的核糖体tRNA：转运氨基酸密码子：共64个密码子，有61个用于编码20个氨基酸，另外还有3个作为终止密码(UAA、UAG、UGA)二、基因及其表达调控基因：合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核酸序列。一个基因不仅包括编码序列，还包括所需的调控序列、5’端不翻译序列、内含子和3’非翻译序列等所有核酸序列基因组：一个生物体的所有基因。人类指23对染色体中的所有基因基因及其表达调控基因表达调控：多层次DNA及染色体水平转录水平转录后水平翻译水平蛋白质加工水平三、人类基因缺陷的主要类型突变指突变体中DNA结构的任何改变，致使基因作用（结构蛋白、酶等），以致个体表型改变（一）点突变：单个核苷酸的置换（1）同义突变：GAUGAC均是天门冬氨酸密码子（2）错义突变：翻译出的氨基酸改变（3）无义突变：产生提前出现的终止密码子（4）延长突变：终止密码子突变为氨基酸密码子人类基因缺陷的主要类型（二）缺失或插入小的缺失或插入，碱基数量非3的整倍数，称移码突变，若为3的整倍数，出现密码子的插入或缺失（三）染色体畸变染色体结构发生大范围改变：倒位、缺失、插入、易位四、基因工程基因工程是指在体外的条件下，人工将DNA分子“剪切”并重新“拼接”，形成一个新的杂合的DNA分子，然后将它导入微生物或真核细胞内进行扩增，使该基因在细胞内高效表达，从而产生人类需要的基因产物或改造、创造新的生物类型基因工程基因工程的基本程序（1）带有目的基因的DNA片段的获得（2）DNA片段与载体DNA连接（体外重组）（3）连接产物导入宿主细胞（4）重组体的扩增、筛选与鉴定（5）目的基因在细胞中的表达（6）表达产物的分离、鉴定等基因工程（一）基因工程的工具酶限制性核酸内切酶核酸修饰酶：连接酶、聚合酶、核酸酶、碱性磷酸酶等（二）基因工程的宿主细胞和载体原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌宿主细胞真核细胞：哺乳动物细胞大肠杆菌：质粒、噬菌体衍生载体常用载体哺乳动物细胞：单链噬菌体载体、逆转录病毒、腺病毒基因工程（三）目的基因的分离已知基因的获得：限制性内切酶酶切法PCR法、RT-PCR法、人工合成DNA片段法基因文库筛选法未知基因的获得：蛋白质DNA策略基因工程（四）目的基因与载体的连接工具：DNA连接酶产物：重组体（五）重组DNA分子导入宿主细胞转化：导入细菌转染：导入噬菌体、病毒宿主菌必须是限制酶缺陷型和DNA重组缺陷型基因工程（六）重组体的筛选直接筛选法：借助遗传表型进行筛选插入失活法：pBR322质粒结合氨苄青霉素（Ap）和四环素（Tc）抗性基因，插入后失活Tc插入表达法：pTR262质粒的四环素抗性（Tcr）基因上游cI基因，插入后cI基因失活，抗性表达（七）克隆基因的表达基因工程插入失活法筛选重组体示意图基因诊断一、基因诊断的基本原理运用现代分子生物学和分子遗传学方法检测基因结构及其表达功能是否正常，从而对人体状态和疾病作出诊断。基因诊断检测的靶物是DNA或mRNA基因诊断二、基因诊断的特点1高度特异性2高灵敏度及精确性：PCR方法克检测出pg级水平靶基因3早期快速：结合杆菌培养需几周，痰涂片染色阳性率低，PCR方法一个工作日确诊4被测基因不一定处于活化状态三、基因诊断的临床意义1优生优育3预防医学2器官移植4感染性疾病核酸分子杂交技术定义：依据DNA双链碱基互补、变性和复性原理，用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列的方法核酸分子杂交技术一、探针的特征和种类探针是一段与被测核苷酸序列互补的带标记的核苷酸片段特征：1要加以标记，带示踪物2单链3选取基因编码序列4高度特异性5长度十几到几千碱基6标记探针高灵敏度、稳定，标记方法简便、安全种类：基因组DNA探针、cDNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针核酸分子杂交技术二、探针的标记物放射性核素：32P、35S、3H、125I、131I非放射性物质：生物素、地高辛、荧光素、酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶等）及金属Hg等三、核酸分子杂交方法液相杂交；固相杂交固相载体：硝酸纤维素膜、尼龙膜、乳胶、磁珠等核酸分子杂交技术杂交基本程序核酸分子杂交技术几种固相核酸分子杂交方法：1Southern印迹杂交法：DNA分子经酶切核琼脂糖凝胶电泳后，放入碱溶液中变性，将变性后的单链DNA从凝胶上吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上用与杂交核酸分子杂交技术2Northern印迹杂交法：经典的RNA分析法，类似Southern印迹，主要区别是在变性剂存在下，以琼脂糖凝胶电泳分离RNA3斑点或狭缝杂交4原位杂交：核酸分子探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交核酸分子杂交技术四、杂交信号的检测1放射自显影：X光片检测放射性核素标记物2非放射性探针检测：（1）偶联（2）显色：酶促、荧光、化学发光聚合酶链式反应（PCR）1985年KaryBM创建了聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR)技术，又称体外基因扩增技术，该技术可扩增核酸靶序列，增加106倍，极大提高检测灵敏度原理：利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在附加的一对引物之间诱发聚合酶反应。PCR全过程由DNA模板变性、模板与引物结合及引物延伸三个步骤组成聚合酶链式反应（PCR）PCR反应的原理示意图1DNA模板变性2模板与引物结合3引物延伸聚合酶链式反应（PCR）PCR条件的优化1模板核酸：来源广泛、需部分纯化、去除DNA聚合酶抑制剂一般宜用ng级的克隆DNA，g水平的染色体DNA或104拷贝的待扩增模板用于检测目的，扩增片段长度一般不超过500bp，以100-300bp为好2引物应纯化，浓度不宜过高一般终浓度为0.2-1.0mol/L聚合酶链式反应（PCR）3缓冲液目前最常用PCR反应的缓冲液体系为10-50mmol/LTris-HCl（PH8.3-8.8，20°C）偏碱性有利于TaqDNA聚合酶作用缓冲液中50mmol/LKCl利于引物退火Mg2+对产量和特异性有显著影响，过高特异性下降；过低产量减少。在各种dNTP浓度为200mol/L时Mg2+为1.5-2.0mmol/L较合适聚合酶链式反应（PCR）4dNTP浓度常采用50-200mol/L的dNTP4种dNTP浓度要一致5TaqDNA聚合酶用量在100l总反应液中，一般所需TaqDNA聚合酶用量为0.5-5U，通常加入2.5U，足以达到每分钟延伸1000-4000个核苷酸速度聚合酶链式反应（PCR）6循环参数（1）变性温度与时间94°C30s（2）退火温度与时间退火温度决定反应特异性取决于引物的长度、浓度和碱基组成（G+C含量）。长度为15-25bp时，退火温度可根据Tm=4（G+C）+2（A+T）（3）延伸温度与时间72°C待扩增片段〈1kb，1min；〉1kb3-4min（4）循环次数20-25个循环聚合酶链式反应（PCR）PCR扩增产物分析法（1）凝胶电泳法（2）点杂交分析结果（3）微孔板夹心杂交法（4）PCR-ELISA法限制性片段长度多态性分析概念：当DNA序列差异发生在限制性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复致使基因组DNA经限制性内切酶水解发生片段改变。这种在同种生物不同个体间出现不同长度限制性片段类型，就是限制性片段多态性（RFLP）限制性片段长度多态性分析人类基因组存在两类多态性：1限制性内切酶酶切位点改变造成的RFLP2串联重复顺序拷贝数不同造成的多态性）VNTR）RFLP可用于遗传病的产前诊断等