分子生物学第22章

1第二十二章核酸剪接在各级生物中都存在割裂基因(Interruptedgenes)。在低等真核生物的基因中割裂基因仅占很小的一部分，但是在高等真核生物基因组中绝大部分都是割裂基因。由于内含子的数目和长度不同使基因间长度差别很大。在一个典型的哺乳动物基因中约有7~8个外显子，分布在16kb左右的范围内。外显子较短(100~200bp)，内含子较长(1kb)。由于基因是割裂结构而它的mRNA却是非割裂结构，所以初级转录物就需要进行加工。初始转录产物称为pre-mRNA，具有和基因一样的割裂结构。去除内含子后的成熟mRNA约为2.2kb。内含子的去除过程就称为RNA剪接或剪接(RNAsplicing)。高等真核生物中，核基因与其产物间长度上存在差异，而这种差异的本质是由核RNA的性质决定的。核RNA的平均长度比mRNA长，非常不稳定，序列的复杂程度也非常高，称为不均一核RNA(heterogeneousnuclear,hnRNA)。其中包括pre-mRNA，也包括其它的转录物(即那些最终没有形成mRNA的部分)。hnRNA的物理结构是一个核糖核蛋白颗粒(hnRNP)，颗粒中蛋白质包围着hnRNA。体外研究表明，hnRNA的形状是一个球体和一个与之相连的纤维状结构(图22.1)。颗粒中绝大多数为核心蛋白质，但也有其它蛋白质少量存在，蛋白质的种类在20种左右。每个核中，与106个分子的hnRNP相比，这些蛋白质的拷贝数约有108。hnRNP的精确结构和RNA以这种形式存在的作用还有待进一步探讨。图22.1hnRNA是由许多小珠状结构形成的核蛋白颗粒。图22.2在细胞核中，RNA的加工包括3′和5′修饰以及内含子的去除等。剪接需要在内含子与外显子结合处产生断裂，然后将外显子末端相连。从图中的放大演示可以看到RNA加工的基本流程，但这并不代表实际行为的发生顺序。成熟的mRNA通过核孔被运到胞质中去，在细胞质中完成翻译。PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion剪接发生在核内，与其它一些修饰同时进行，以产生新合成的RNA。一个割裂基因的表达过程如图22.2所示。转录物在完成5′端加帽(见第5章)，内含子的去除(本章)，3′端加多聚腺嘌呤尾巴(本章)后，通过核孔进入胞质进行翻译。关于发生在核内的各种反应过程，和其它RNA修饰相比，我们应该知道剪接发生的位点。剪接是否发生在一个特殊位点，是否与核质转运等其他事件相关？如果不发生剪接，非割裂基因的表达过程是否会出现很大差异？对于剪接反应本身来说，一个最主要的问题是如何保证它的准确性。是什么确保了每个内含子末端可以被准确的识别，并把正确的序列从RNA中剪接掉？从前体中切除内含子的过程是否是按照特定的顺序进行？成熟RNA是通过有效前体间的识别，还是通过改变剪接机制来调控基因表达的？我们把剪接系统分为以下几类：高等真核生物核内RNA内含子的去除是通过识别内含子与外显子交界处及内含子内部保守的短共有序列来进行的。这个反应需要大量的剪接元件，元件是以一系列蛋白质和核糖核蛋白的形式存在的，核糖核蛋白是一个大的颗粒复合体(剪接体)。有的内含子去除是RNA的自我剪接。在不同的位置发现了两类内含子具有这样的功能。每一种内含子都形成一种特殊类型的二级结构。RNA的这种酶活性在类病毒的自我切除和RNAaseP的催化活性中都有体现。我们将在23章讨论此反应。酵母tRNA前体中内含子的去除需要蛋白质酶的参与，该酶处理底物的方式类似于tRNA的底物合成酶，因为都有tRNA前体的形成。剪接机制有两种基本类型。除pre-tRNA外所有的内含子都是通过转酯反应进行的，尽管催化和其它组分在每种类型中都各不相同。核pre-tRNA内含子的剪接是通过磷酸二酯键的断裂和连接反应进行的。许多内含子的自我剪接机制是可变的，也就是说，他们具有在新位点插入拷贝的能力。这就意味着他们可能是由原始基因中片段的插入而形成的(见23章)。高等真核生物核基因中的内含子是起源于这些基因中的插入还是它们原始基因的一部分，我们还不清楚。pre-tRNA中的内含子很可能来源于原始基因内部片段的插入。22.1剪接位点是可交换的，但仍被成对识别为了明确核内含子剪接的分子机制，我们必须清楚剪接位点的特点，包括断裂和连接点在内的两个外显子-内含子交界区域。通过比较mRNA和相应结构基因的核苷酸序列，可以发现外显子与内含子的连接点有一些特点。一个内含子两端并没有很强的同源性或互补性，然而，连接点尽管非常短但是仍有极端保守的共有序列。根据外显子-内含子连接点的保守性，人们明确了内含子末端是特定的共有序列(图22.3)。在每个保守位点处，下标代表该位置规定碱基出现的百分率。在内含子连接点处发现了高度保守的序列，一般内含子中此序列为GT…AG。因为内含子两端剪接点的识别是根PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion，结束点是AG来确定的，所以剪接点的这种特征又称为GT-AG规则(Rule)(实际上RNA中的序列是GU-AG)。因为两个剪接位点的序列不同，所以可以直接确定内含子的两末端。按照内含子的方向从左到右称为左(5′)剪接点和右(3′)剪接点。有时又叫做供体位点(Donor)和受体位点(Acceptor)。剪接位点的突变在体内和体外试验中都可以阻止剪接的进行。典型的哺乳动物mRNA中有多个内含子。由于剪接位点序列很简单，核酸剪接的基本问题如图22.4所示：什么保证了正确碱基对的剪接？相应的GU-AG对必须通过很长的距离连起来(有时内含子的长度大于10kb)，而避免非正确碱基对的连接。可能有两种机制来保证正确的5′和3′位点碱基间的配对。图22.3内含子的末端按GT-AG规则定义。RNA本身有一种性质使内含子末端的某一点连接起来，这可能需要RNA具有特定的序列或结构。所有的5′剪接位点都具有相同的功能，所有的3′剪接点没有结构上的区别，剪接遵循着某一规则，保证5′剪接点正确地与3′剪接点相连。剪接位点及其周围区域并没有任何互补序列，这并不包括内含子末端的配对。RNA前体杂交试验表明，任何5′剪接点原则上能与任何3′剪接点相连。例如，将SV40早期转录单位的第一个外显子连接到鼠的β-珠蛋第三个外显子后面，杂合的内含子能被准确剪接，产生SV40外显子和β-珠蛋白外显子的杂合体。从这个试验得出两点结论：剪接位点具有通用性，单个RNA前体没有特殊性，并没有为剪接传递特殊信号(例如二级结构)。剪接装置没有组织特异性，RNA在任何细胞中都可正确剪接，而不必考虑是否是在某个细胞中合成的(我们以后讨论一个特例，剪接机制具有组织特异性)。有一个情况很令人迷惑，对于剪接机制来说所有的5′和3′位点都是相似的。原则上任一5′剪接点可与3′剪接点发生剪接，但实际上剪接只发生在同一个内含子的5′和3′剪接点间，其机制尚不明。在RNA剪接过程中，内含子的去除是否有特定的顺序？RNA印迹法(RNAblotting)可用于分析核RNA剪接过程中的中间体，从而确定内含子去除的顺序。图22.5所示是一个卵粘蛋白(Ovomucoid)mRNA前体的印迹结果，出现一系列不连续的带说明剪接有特定的途径。如果内含子的去除是随机的，理论上应有300种以上的中间体出现，我们不会看PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion到这些不连续的带。图22.4正确的剪接结合是建立在正确的配对组合基础之上的(哺乳动物mRNA)。图22.5通过对核RNA与卵类粘蛋白探针的RNA印迹分析，可以辨别出后者几个差别很大的RNA前体(说明剪接有特殊的途径，并非随机去除)。因为发现了含不同内含子的中间产物，因此内含子的去除好像没有特定的顺序。事实上也有一定的规律，当只去除一个内含子时，该内含子总是内含子5或6；当去除两个时，包括内含子5或6的情况占多数，但也有其它情况。内含子3很少在剪接的前三步被去除。上述内含子的去除次序可以总结为5/6，7/4，2，3/1。肯定还存在其它方式，因为也有第4或7个内含子最后才去除的情况。在解释这些结果时有一个漏洞，因为我们并没有证明这些中间体最后真能成为成熟的mRNA。根据以上分析得出结论，RNA的构象影响剪接点的选择，在去除特定的内含子后，构象发生改变，再选择新的剪接点。但前体在去除内含子时有不同的次序说明，每一个剪接阶段都可以有不同的构象。当然分子越长可供选择的结构越多；基因越大，越难分析二级结构对剪接的控制。可以得出一个重要结论，剪接反应并不是按照内含子在RNA前体上的顺序进行的。有一个简单模型控制剪接位点的识别，它需要剪接装置按照一种连续的方式起作用。在识别5′剪接位点以后，剪接装置沿RNA前体分子方向移动，直到遇到下一个3′剪接点，这就保证了剪接仅在相邻位点间发生。但也有实验否定了此模型，试验表明，在特殊情况下(见后面)或RNA分子中的部分核苷酸链被一个聚乙二醇(Polyethanolglycol)连接体替代时，能发生反式剪接。所以剪接装置并不需要一定要按5′到3′的方向进行移动。模型存在的另一个问题是它不能解释选择性(Alternative)剪接的存在，例如在SV40中，多个3′剪接点与同一个5′剪接点进行剪接。正确的剪接位点的识别机制还不清楚。PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion核酸剪接要经过一个套索结构通过体外剪接系统可以研究剪接机制，该系统中的内含子可以从RNA前体中去除。核提取物能完成RNA前体的剪接，这说明剪接与转录过程无关。剪接与RNA的修饰状态也没有关系，没有帽子结构和poly(A)尾巴的RNA都能完成剪接。体外的剪接阶段如图22.6所示。我们把RNA按照可以识别的类别，分别讨论其剪接反应，但需要注意体内含外显子的RNA并不是自由分子。图22.6剪接分两个阶段进行，5’外显子首先被分开，然后与另一外显子的3’相连。图22.7核基因剪接中有两步转酯反应。转酯反应中由一个自由羟基进攻磷酸二酯键。第一阶段，内含子的5′端切开，形成游离的左侧外显子和右侧的内含子-外显子分子。左侧的外显子呈线状。右侧的内含子-外显子分子形成一个套索(Lariat)结构，而内含子游离的5′端通过5′-3′磷酸二酯键与一个碱基相连，目标碱基是A，称为分支位点(Branchsite)。第二阶段，内含子的剪接点被切断然后以套索状释放，与此同时右侧的外显子与左侧的外显子连在一起。为了阐述明白，断裂和连接反应以图的形式分别表示，但实际上它们是同时发生的。然后套索被切开，形成线状并很快被降解。完成剪接所需要的序列是位于5′和3′端剪接点和分支位点的短共有序列。大部分内含子序列的缺失都不会影响剪接的发生，这表明剪接过程不需要内含子或外显子的特定构象。3′剪接点的识别是以分支位点的方式进行的。酵母中的分支位点是高度保守的，具有共有序列UACUAAC。高等真核生物中的分支位点并没有很强的保守性，但在每一位点上都有嘌呤或嘧啶碱基的偏好，并且目标碱基也是A。PDFcreatedwithFinePrintpdfFactoryProtrialversion个核苷酸处。酵母中分支位点的突变或缺失都会阻碍剪接的进行。高等真核生物中，分支位点序列有一定灵活性，当分支位点缺失时，可以在附近区域选择其它类似的序列来替代。与3′剪接点相邻是很重要的，因为替代位点总是接近于原来的分支位点。当替代位点起作用时，剪接过程可以正常进行，产生与野生型相同的剪接产物。因此分支位点的作用是选择距之最近的3′剪接点作为与5′剪