分子生物学笔记

第一章基因的结构第一节基因和基因组一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列．一个典型的真核基因包括①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR)④调控序列(可位于上述三种序列中)绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。二、基因组(genome)一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X109(30亿bp)，共编码约10万个基因。每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-valueParadox)。人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）基因组学（genomics）,结构基因组学（structuralgenomics）和功能基因组学（functionalgenomics）。蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics）第二节真核生物基因组一、真核生物基因组的特点：①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中．②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3％)，二、真核基因组中DNA序列的分类??(一)高度重复序列(重复次数lO5)卫星DNA(SatelliteDNA)(二)中度重复序列1．中度重复序列的特点①重复单位序列相似，但不完全一样，②散在分布于基因组中．③序列的长度和拷贝数非常不均一，④中度重复序列一般具有种属特异性，可作为DNA标记．⑤中度重复序列可能是转座元件(返座子)，2．中度重复序列的分类①长散在重复序列(longinterspersedrepeatedsegments．)?LINES②短散在重复序列(Shortinterspersedrepeatedsegments)?SINESSINES：长度500bp，拷贝数105．如人Alu序列LINEs：长度1000bp(可达7Kb),拷贝数104-105，如人LINEl(三)单拷贝序列(UniqueSequence)包括大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列，三、基因家族(genefamily)一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因．可能由某一共同祖先基因(ancestralgene)经重复(duplication)和突变产生。基因家族的特点：①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(genecluster)或串联重复基因(tandemlyrepeatedgenes)，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；③有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene)．Ψa1表示与a1相似的假基因．假基因分类。加工过的假基因(processedpseudogene)。典型的基因家族1．tRNA基因?单倍体人基因组中1300个tRNA基因，tRNA基因簇．2．rRNA基因l00copy．rRNA基因簇(重复单元28S、18S、5.8s-rRNA)3．组蛋白基因30-40copy．定位：7q32-q36组蛋白基因簇(重复单位：H1，H2A，H2B，H3、H4)特点：无intron，Poly(A)-RNA．?4．珠蛋白基因α类：16p13，基因簇(24Kb)：5’—ζ—Ψζ—Ψα1—α2—α1—3’β类：11p15，基因簇(60Kb)：5’—ζ—Gr—Ar—Ψβ—δ—β—3’四、超基因家族(Supergenefamily，Superfamily)由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同．五、人类基因组中的重复序列标记1、A1u序列单倍体人基因组50万-100万拷贝，平均每隔3-6Kb就有一个Alu序列，人A1u序列长300bp：2X130bp重复序列；?+31bp间隔序列(中间)；两侧7-21bp正向重复(directrepeats)，返座子?Alu序列广泛散布于人基因组，约90%巳克隆的人基因合有Alu序列Alu序列标志。2、可变数串联重复???，??Variablenumbertamdemrepeat，VNTR．又称小卫星DNA(minisatelliteDNA)由短重复单位(6-40bp)串联重复(6-100次以上)而成，多位于基因的非编码区，广泛分布。VNTR多态性—分子标记—DNA指纹图（fingerprint）.小卫星DNA突变与肿瘤，H-Ras。3、短串联重复（shorttandemrepeat,STR）又称微卫星DNA（microstalliteDNA）2-6个核苷酸组成的重复单位串联重复(10-60次),两侧为特异的单拷贝序列，人基因组中每l0kbDNA序列至少一个STR序列。{CA)n，50，000-100，000拷贝．新一代遗传标记，人类基因组研究，肿瘤，遗传病．第三节线粒体基因组人线粒体基因组的特点：1、人线粒体基因组为16，569bp的双链闭环分子，一条链为重链(H链)，一条链为轻链(L链)，两条链均有编码功能，每个mtDNA分于编码13种蛋白质和24种结构RNA(22rRNA，2tRNA)．2、线粒体DNA为母系遗传．3、结构基因不含内含子，部分区域有基因重叠，因此病理性mtDNA突变更易发生．4、mtDNA突变频率更高．5、线粒体DNA突变的表型表达与核DNA不同。第四节细菌和病毒基因组一、细菌基因组的特点。1．功能相关的几个结构基因往往串联在—起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构，2．结构基因中没有内含子，也无重叠现象。3．细菌DNA大部分为编码序列。二、病毒基因组的特点1．每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA；2．病毒核酸大小差别很大，3X103一3X106bp；3．除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。4．大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成．?5．真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子．6．有重叠基因．第五节染色质和染色体细胞分裂间期—染色质(chromatin)分裂期—染色体(chromosome)一、染色质的基本单位—核小体(一)核小体(nucleosome)结构DNA绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各一对)核心外1.8周(146bp),形成核小体核心颗粒。两个核小体核心颗粒之间有LinkerDNA(0-80bp)，核小体核心颗粒+Linker=核小体(长180-210bp)核小体DNALadder．(二)组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷富含Lys，Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力．组蛋白分类：1．核小体核心组蛋白，H2A，H2B，H3，H4。分子量较小(102-135aa)作用：盘绕DNA形成核小体。2．H1组蛋白：较大(220aa)，作用：与LinkerDNA结合后利于核小体稳定和更高级结构的形成??。二、染色质的高级结构1、30nm染色质纤丝?，2、袢环结构(loopeddomain)?。3、细胞分裂期染色体分裂期染色体=一对姐妹染色单体（Chromatid)有丝分裂中期46条染色体按大小和形状排列的的光学显微镜图像称为人的染色体核型(Karyotype)三、染色体的结构要素?。(一)．着丝粒（centromere)：细胞分裂时染色体与仿锤丝相连结的部位，为染色体的正常分离所必需。?(二)．端粒(telomere)：真核生物线状染色体分子末端的DNA区域端粒DNA的特点：1、由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb)．人的端粒DNA重复序列：TTAGGC。2、端粒的末端都有一条12-16碱基的单链3’端突出。端粒的作用：防止DNA末端降解，保证染色体的稳定性和功能（三）、复制原点.第三节DNA双螺旋的呼吸作用甲醛的变性实验呼吸作用的定义碱基对的稳定性生物学作用第四节DNA的变性复性和分子杂交一、变性(溶解)在某些物理化学因子的作用下，DNA双链间的氢键断裂，双链解离形成单链。㈠性质变化增色效应；黏度降低；沉降速度增加。㈡因素⑴温度：温度升高引起的DNA变性称热变性。加热使氢键断裂。可用热变性曲线描述热变性过程。见下图融点Tm：50%DNA分子解链时的温度。融点与DNA分子中的GC有关，随（G+C）%的含量呈线性增加⑵化学：甲酰胺破坏氢键二、复性去除变性条件后，单链DNA在适当条件下重新形成双链，回复到原有的物理和生物学特性。㈠复性动力学复性过程是两条单链DNA碰撞形成双链DNA的过程，是双分子反应。服从二级反应动力学规律。控制复性反应的两个参数是C0和tRateofreactionThereactionfollowsthesecondorderequationCistheconcerntrationofDNAthatissingle-strandedattimetkisareassociationrateconstant.ProgressofreactionIntegratetherateequationbetweenthelimits;InitialconcerntrationofDNA=C0attimet=0;Concentrationremainingsinglestranded=CaftertimetCriticalparameterisC0t1/2Whenthereactionishalfcompleteatthetimet=1/2ThereforeC0t1/2=1/k.复性反应进行到50%时的C0.t为C0t1/2C0t曲线：用已经复性的DNA浓度，即1－C/C0对C0t的对数作图。如右图所示.C0t值的意义：C0t1/2值可以用来表示反应体系中DNA的总长度（单拷贝）。这种总长度称为DNA的复杂性。通过测定复性动力学可以预测基因组的大小。真核基因组DNA的复性动力学：第1是快复性动力学组分，高度重复序列。第2是中复性动力学组分，中度重复序列。第3是慢复性动力学组分，单拷贝序列。X：DNA的复杂性C0t曲线特征：⑴原核生物每种图形的现状大致相同；⑵重复序列多,复性快。曲线意义：求DNA的复杂度。三、分子杂交原理：基于DNA的变性与复性的特性。双链DNA加热以后，变成单链，在去除变性条件后，在一定的条件下，具有互补顺序的DNA能再形成双链。探针：一种标记的一段DNA或RNA，与待测基因序列的DNA或RNA互补分子杂交技术的种类：⑴固相杂交（待测核酸固相化）；⑵Southernblot，待测核酸为DNA；⑶Northernblot，待测核酸为RNA。液相原位杂交示意图：⑴Dotshybridization，点状杂交，待测核酸为DNA或RNA；⑵Colonyorplaquehybridization，菌落或噬菌班杂交，待测核酸为DNA。⑶Tissuehybridization，组织原位杂交，检测mRNA表达和定位。研究基因的定位，拷贝数，测序。菌落原位杂交：基因文库：染色体DNA文库，cDNA文库。第三章基因和基因组一、原核生物基因组⒈特征⑵通常含有质粒；⑶操纵子结构；⑷顺反子；⑴只有一个染色体；⑸有SD序列；⑹基因重叠；⑺一般没有内含子；⑻只有一个复制起始位点；⑼以RNA为产物的基因往往是多拷贝的，蛋白质基因单拷贝。⒉⑴фX174；⑵λ噬菌体1．染色体、核小体结构二、真核生物基因组⑴染色体功能实现三要素：①着丝点；②端粒；③复制起始点。⑵基因组大小和C值矛盾C值：单倍体基因的全部DNA含量。C值矛盾：①与预期相比，C值明显过大；②同一物种，C值相差很大。⑶基因组的基因数目（下表：不同生物的基因数目）。种类基因组大小（bp）基因数目支原体1.0×106750噬菌体T41.6×105200大肠杆菌4.2×1062350酵母1.3×1076100果蝇1.4×1088750人3.3×10965000-80000⑷真核生物基因组序列特征：具有多个复制起始位点；编码序列仅