利用磷脂脂肪酸（犘犔犉犃狊）生物标记法分析水稻根际土壤微生物

书书书利用磷脂脂肪酸（犘犔犉犃狊）生物标记法分析水稻根际土壤微生物多样性刘　波１　胡桂萍１　郑雪芳１　张建福２　谢华安３，（１福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建福州３５０００３；２福建省农业科学院水稻研究所，福建福州３５００１８；３国家水稻改良中心福州分中心，福建福州３５００１８；通讯联系人，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]）ＡｎａｌｙｓｉｓｏｎＭｉｃｒｏｂｉａｌＤｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｈｅＲｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆＲｉｃｅｂｙＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄＦａｔｔｙＡｃｉｄｓＢｉｏｍａｒｋｅｒｓＬＩＵＢｏ１，ＨＵＧｕｉｐｉｎｇ１，ＺＨＥＮＧＸｕｅｆａｎｇ１，ＺＨＡＮＧＪｉａｎｆｕ２，ＸＩＥＨｕａａｎ３，（１犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犅犻狅犾狅犵犻犮犪犾犚犲狊狅狌狉犮犲犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犉狌犼犻犪狀犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犉狌狕犺狅狌３５０００３，犆犺犻狀犪；２犚犻犮犲犚犲狊犲犪狉犮犺犐狀狊狋犻狋狌狋犲，犉狌犼犻犪狀犃犮犪犱犲犿狔狅犳犃犵狉犻犮狌犾狋狌狉犪犾犛犮犻犲狀犮犲狊，犉狌狕犺狅狌３５００１８，犆犺犻狀犪；３犉狌狕犺狅狌犅狉犪狀犮犺，犆犺犻狀犲狊犲犖犪狋犻狅狀犪犾犆犲狀狋犲狉犳狅狉犚犻犮犲犐犿狆狉狅狏犲犿犲狀狋，犉狌狕犺狅狌３５００１８，犆犺犻狀犪；犆狅狉狉犲狊狆狅狀犱犻狀犵犪狌狋犺狅狉，犈犿犪犻犾：犺狌犪犪狀狓犻犲＠狔犪犺狅狅．犮狅犿．犮狀）ＬＩＵＢｏ，ＨＵＧｕｉｐｉｎｇ，ＺＨＥＮＧＸｕｅｆａｎｇ，ｅｔａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆｒｉｃｅｂｙｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．ＣｈｉｎＪＲｉｃｅＳｃｉ，２０１０，２４（３）：２７８２８８．犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｎｒｉｃｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ（ＰＬＦＡｓ）ｗｉｔｈｓｅｖｅｎｈｙｂｒｉｄｒｉｃｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓａｓｍａｔｅｒｉａｌｓｕｎｄｅｒｔｈｅｓａｍｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＴｈｅＰＬＦＡｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＭＩＤＩｓｙｓｔｅｍｔｏｇｅｔｔｈｅｂｉｏｍａｒｋｅｒｓａｎｄｔｏｃａｌｃｕｌａｔｅｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｈｅｑｕａｎｔｉｔｙｓｔａｔｉｓｔｉｃｆｏｒｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｉｎｔｈｅｒｉｃｅｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ３８ＰＬＦＡｓｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ，２３ｏｆｗｈｉｃｈｗｅｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄｉｎｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆｔｈｅｓｅｖｅｎｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄ１５ｉｎｔｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｏｆｓｏｍｅｏｆｔｈｅｈｙｂｒｉｄｒｉｃｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．ＴｈｅｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆＰＬＦＡｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｅｉｔｈｅｒｔｈｏｓｅｔｏｆｕｎｇｉｏｒｔｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ．ＴｈｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｂｙＰＬＦＡｓｗａｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｂｉｏｌｏｇｙｏｆｒｉｃｅｍａｔｅｒｉａｌｓ．ＴｈｅＰＬＦＡｓｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｅｆｆｅｃｔｉｖｅｐａｎｉｃｌｅｓａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｙｉｅｌｄ，ｗｈｅｒｅａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔｏｆｒｉｃｅ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｃｌｕｓｔｅｒａｎａｌｙｓｉｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｔｈａｔｔｈｅＰＬＦＡｓｗｅｒｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｒｉｃｅｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．ＩｔｉｓｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｂｙＰＬＦＡｓｉｎｒｉｃｅｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅｗａｓｒｉｃｈ，ｗｈｉｃｈｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｙｒｅｆｌｅｃｔｅｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＰＬＦＡｓａｎｄｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｙ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｒｉｃｅ；ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ；ｓｏｉｌｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓ；ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ刘　波，胡桂萍，郑雪芳，等．利用磷脂脂肪酸（ＰＬＦＡｓ）生物标记法分析水稻根际土壤微生物多样性．中国水稻科学，２０１０，２４（３）：２７８２８８．摘　要：采用磷脂脂肪酸（ＰＬＦＡｓ）生物标记法，分析了４个以Ⅱ３２Ａ为母本和３个以制５为父本的系列杂交水稻组合在同等栽培条件下根际土壤的微生物群落结构，并探讨其与水稻特性的内在联系，以期为水稻育种和品种改良提供科学依据。结果表明，水稻根际土壤磷脂脂肪酸生物标记丰富，共检测到３８种ＰＬＦＡｓ，其中完全分布的生物标记有２３种，不完全分布的有１５种；水稻根际土壤中ＰＬＦＡｓ含量细菌＞真菌＞放线菌。不同水稻材料根际土壤微生物磷脂脂肪酸生物标记组成结构存在差异。对根际土壤特征磷脂脂肪酸生物标记１６：０（细菌）、１８：１ω９ｃ（真菌）、１０Ｍｅ１７：０（放线菌）、１０Ｍｅ１６：０（硫酸盐还原细菌）和１６：１ω５ｃ（甲烷氧化菌）比较可知，制５系列组合含量高，最高的为金生优制５，Ⅱ３２Ａ系列组合较低，含量最低的为Ⅱ优７９７。对ＰＬＦＡｓ总量和水稻特性进行Ｐｅａｒｓｏｎ相关分析，结果表明，ＰＬＦＡｓ含量与水稻有效穗数和产量呈显著正相关，但与株高呈显著负相关。对水稻根际土壤磷脂脂肪酸生物量总量进行聚类分析发现，Ⅱ３２Ａ系列组合聚为一类，制５系列组合聚为一类，表现出水稻遗传特性在其根际ＰＬＦＡｓ上的差异性。研究结果表明，水稻根际土壤微生物群落ＰＬＦＡｓ结构丰富，根际土壤微生物群落结构受水稻遗传亲缘关系的影响。关键词：水稻；根际；土壤微生物；磷脂脂肪酸；多样性中图分类号：Ｑ９３８．１＋３；Ｓ１５４．３　　　　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００１７２１６（２０１０）０３０２７８１１　　水稻根际及微生物组成了一个特殊的生态系统，不同的水稻品种孕育着不同的根际土壤微生物群落［１］。根际土壤微生物具有繁殖快、数量多、代谢能力强的特点，它对根际土壤有机质的分解、无机质的转化、氮的固定以及对植株养分吸收、植株生长发育都具有明显的影响［２］。此外，根际土壤微生物种群结构与作物产量密切相关，微生物种群结构失衡是导致作物减产的主要原因之一［３５］。诸多研究表明，作物品种不同，其根际土壤微生物的结构不收稿日期：２００９０８１０；修改稿收到日期：２０１００１１５。基金项目：国家８６３计划资助项目（２００６ＡＡ１００１０１；２００６ＡＡ１０Ａ２１１）；福建省财政专项福建省农业科学院科技创新团队建设基金资助项目（ＳＴＩＦＹ０３）。第一作者简介：刘　波（１９５７－），男，博士，研究员，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]。８７２中国水稻科学（犆犺犻狀犑犚犻犮犲犛犮犻），２０１０，２４（３）：２７８～２８８ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｉｃｅｓｃｉ．ｃｎＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１７２１６．２０１０．０３．０１１同，它们之间的关系是协同进化的关系［６７］。探讨作物与其根际土壤微生物多样性的内在联系，对于了解作物品种遗传特性、营养特征、土壤适应性等具有重要的意义［８］。关于植物根际土壤微生物的群落，国内外学者有过许多研究。Ｈａｎ等［９］利用平板计数、磷脂脂肪酸生物标记法（ＰＬＦＡｓ）和ＢＩＯＬＯＧ微平板技术对大豆、人工草地、人工灌丛、天然灌丛、玉米等根际微生物群落进行研究，发现大豆根际土壤微生物多样性高于其他植物。Ａｒａｂ等［１０］采用培养法和ＰＬＦＡｓ法研究不同抗性的两个小麦品种根际土壤微生物群落结构，结果表明，小麦品种Ｂｏｈｏｕｔｈ６根际土壤所含革兰氏阴性细菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊）明显高于Ｓａｌａｍｏｕｎｉ。Ｋｉｍｕｒａ等［１１］利用ＰＬＦＡｓ技术分析水稻根际土壤微生物群落结构，结果表明，水稻根际土壤中革兰氏阳性菌多于革兰氏阴性菌。然而，基于ＰＬＦＡｓ分析的水稻根际土壤微生物群落与水稻品种特性关系的研究国内外尚未见相关报道。本研究应用ＰＬＦＡｓ技术，以４个用Ⅱ３２Ａ作母本和３个以制５为父本的杂交水稻组合根际土壤为研究对象，探讨相同栽培条件下，不同水稻品种根际土壤微生物群落结构与水稻品种特性，如生长发育特征和遗传亲缘关系之间的内在联系，试图建立不同水稻品种根际土壤微生物群落磷脂脂肪酸生物标记结构特征模式，分析该特征模式与水稻品种特性之间的关系，为水稻育种及品种改良提供科学依据。１　材料与方法１．１　供试材料水稻材料分别为以Ⅱ３２Ａ为母本的Ⅱ优系列杂交水稻组合Ⅱ优７９７（Ⅱ３２Ａ／Ｙ１８）、Ⅱ优ＨＫ０５（Ⅱ３２Ａ／ＨＫ０５）、Ⅱ优３５５（Ⅱ３２Ａ／Ｙ２５）、Ⅱ优４５５（Ⅱ３２Ａ／Ｙ０３）和以制５为父本的制５系列杂交水稻组合新安优制５（新安Ｓ／制５）、金生优制５（金生Ｓ／制５）、天优制５（天丰Ａ／制５），由福建省农业科学院水稻研究所提供。１．２　田间试验设计和性状调查试验于２００８年５月－１１月在福建省沙县夏茂镇长富村进行。于５月１６日播种，大棚旱育苗；６月２６日插秧，随机区组设计，７个组合，３次重复，共２１个小区，小区面积３．６ｍ２，每个小区３行，行长４ｍ，行距３０ｃｍ，穴距１３ｃｍ，每穴插１棵苗，正常大田管理，生育期间调查抽穗期。９月２５日收早熟材料，１０月２２日收中熟材料，１１月８日收晚熟材料。收获时取每个区组中间１０株水稻，考查株高、有效穗数、结实率、千粒重，并计算产量。１．３　根际土壤取样方法根际土壤取样方法采用“抖根法”，即先将植株根系从土壤中挖出，抖掉与根系松散结合的土体，然后将与根系紧密结合在０～４ｍｍ范围的土壤用刷子刷下来作为根际土壤。采样时间为水稻孕穗期，每小区按“蛇形法”随机选５个点采集根际土壤混合样品，装袋迅速带回实验室测定磷脂脂肪酸。每个样品重复３次。１．４　土壤磷脂脂肪酸（犘犔犉犃狊）生物标记分析方法ＰＬＦＡｓ提取和分析参考Ｆｒｏｓｔｅｇｒｄ等［１２］和Ｋｏｕｒｔｅｖ等［１３］的方法。１）磷脂脂肪酸的释放与甲酯化：取１５ｇ土样置于５０ｍＬ离心管中，加入１５ｍＬ０．２ｍｏＬ／Ｌ的ＫＯＨ甲醇溶液，振荡５ｍｉｎ，并于３７℃水浴温浴１ｈ，每１０ｍｉｎ振荡１次；２）中和溶液ｐＨ值：加入３ｍＬ１．０ｍｏｌ／Ｌ的醋酸溶液中和，充分摇匀；３）磷脂脂肪酸的萃取：加入１０ｍＬ正己烷，充分摇匀，８００ｒ／ｍｉｎ下离心１５ｍｉｎ，打开管盖，取上层正己烷于玻璃试管中，吹氮气使溶剂挥发；４）加样测定：在玻璃试管中加入０．５ｍＬ体积比为１∶１的正己烷甲基丁基醚溶液，充分溶解３～５ｍｉｎ，转入ＧＣ小瓶，同时加入１０μＬ浓度为１ｍｇ／ｍＬ的内标１９：０并上机测定。ＰＬＦＡｓ的检测采用美国ＭＩＤＩ公司生产的微生物自动鉴定系统（ＳｈｅｒｌｏｃｋＭｉｃｒｏｂｉａｌＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍＳｈｅｒｌｏｃｋＭＩＳ４．５）进行，包括Ａｇｉｌｅｎｔ６８９０Ｎ型气相色谱仪，全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器；在下述色谱条件下平行分析磷脂脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本：二阶程序升高柱温，１７０℃起始，５℃／ｍｉｎ升至２６０℃，而后４０℃／ｍｉｎ升温至３１０℃，维持９０ｓ