北京大学单分子与纳米生物学实验室

生物物理学的内容分子生物物理学（MolecularBiophysics)生物物理仪器与技术(BiophysicalInstrumentationandTechniques)膜与细胞生物物理学(MembraneandCellBiophysics)理论生物物理学(TheoreticalBiophysics)感官与神经生物物理学(SensoryandNeuralBiophysics)自由基与电磁生物物理学荧光分光光度术Spectrophotofluorimetry一、荧光的发现二、荧光与荧光光谱三、荧光光谱仪及主要谱参量四、荧光生色团的结构特点五、影响荧光测量的因素六、荧光技术在生物学、医学研究中的应用荧光分光光度术夜明珠发光成因1、矿物的发光性矿物在外来的能量激发下，产生可见光的性质称为矿物的发光性。外来的能量有日光、紫外线、X射线、阴极射线、加热、加压、摩擦等。根据其发光的性质不同，分为荧光和磷光二类。2、矿物的发光机理矿物的发光是矿物能量的一种转换过程，物体受激发吸收能量而跃迁至激发态（非稳定态）在反回到基态的过程中，以光的形式放出能量。一荧光的发现1575：N.MonardesLignumNephriticum1852：Stokes分光计植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、奎宁借用萤石的（Fluospar）发光现象而推演，荧光Fluorescence1867年：GoppelsroderAL与桑色素的配合测定AL的含量1880：Liebeman提出“荧光与化学结构关系”的经验法则为荧光技术的开发应用拉开了序幕（一）荧光的产生（二）荧光光谱与吸收光谱二荧光与荧光光谱（一）荧光的产生1分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：Eo=Ee+Ev+ErEe：价电子运动能,electronEv：原子在平衡位置附近的振动,vibrationEr：分子绕其重心的转动能,rotation其中，EeEvEr（一）荧光的产生2分子的能级EnergyLevels与跃迁Transition（二）荧光光谱与吸收光谱荧光分光光度术：又称荧光光谱术，属于光谱技术中的一种发射光谱术。其原理是电磁波和物质作用后，物质首先吸收电磁波的能量，然后再重新发射电磁波。激发波段在100-800nm之间，相当于紫外与可见光波段。（一）荧光光谱仪（二）荧光分光光度术中的参量三荧光光谱仪与主要参量（一）荧光光谱仪吸收光谱仪光路图荧光光谱仪光路图氢灯的能量分布氘灯的能量分布氙灯（红线）和带有玻璃外套的汞灯的能量分布1激发光源在紫外-可见光区，可供荧光激发用的光源很多包括：钨灯，碘钨灯，氢灯，氘灯，汞灯，氙灯等。主要根据光源稳定性和强度选择光源。实践中常不选用强光源：随着光强的增加，会同时导致散射光和热量的增多强光源照射，容易使样品产生光化分解强光源需要的稳压稳流装置复杂而昂贵产生大量臭氧，损害健康对于光源要注意以下几点:（1）正负极不要接错。（2）拿灯时，不要碰窗口，以免手上的油污经紫外照射后，难以清除。应及时用无水乙醇擦干净。（3）灯有寿命，要节约使用。（4）启动间隔一般要大于半小时，待灯冷却后，在重新启动。启动后要预热半小时。（5）不要用眼睛直视灯。2样品池在可见可用玻璃池，但紫外区一定要用石英池。（1）设置空白对照。（2）清洗问题，关键是即时冲洗。自来水冲洗SDS浸泡双蒸水冲洗浓硝酸处理双蒸水冲洗（二）荧光分光光度术中的参量ex—Maximumexcitationwavelengthem,max—MaximumemissionwavelengthA荧光强度的定义：在一定激发波长(λex)作用下，发射的荧光强弱。F=IaIa=I0-I，I=I010-εcLF=I0(1-10-εcL){当C很低时F=I0εcL，{当C较大时F=I0B=发射光子数/吸收光子数2荧光强度（fluorescenceintensity,F,I）与量子产率（quantumyield,）（二）荧光分光光度术中的参量荧光强度与浓度的关系3荧光偏振(fluorescencepolarization)（二）荧光分光光度术中的参量自然光部分偏振光偏振光I//-II//+IP=I//-II//+2IA=荧光偏振度Fluorescencepolarization--p荧光各向异性Fluorescenceanisotropy--A(1)荧光偏振度的物理意义：A：I//=I，P=0，自然光，荧光分子运动很快，取向随机。（稀溶液）B：I//或I为0，P=±1偏振光，荧光分子运动很慢，取向有序。C：I//I0，0P1，生物大分子的荧光属于这种情况。(2)环境因素及分子运动对荧光偏振度的影响A.温度的影响：溶液粘度A：温度的影响温度升高，P降低B：溶液粘度粘度升高，P升高C：分子的运动—转动旋转弛豫时间rotationalrelaxationtime—（二）荧光分光光度术中的参量4荧光寿命（Fluorescenceliftime--）荧光衰减为原来激发时最大荧光强度的1/e所需要的时间I=I0e-kt,=1/k分子所处的环境有无淬灭有无能量转移有无分子间相互作用影响因素5荧光探剂(1)具有环状共轭双键即π电子系统(2)量子产率随环境变化，而且变化很大(3)能产生稳定荧光的小分子藻胆蛋白phycobiliprotein绿色荧光蛋白GreenFluorescentProtein(4)与研究对象的特定基团共价结合或与蛋白质非共价结合（5）荧光探针的应用分类测定细胞活性的荧光探针：活细胞探针和死细胞探针膜荧光探针：荧光基团标记的磷脂，阴离子膜探针，阳离子膜探针，其它非极性和双亲性膜探针。细胞器荧光探针：线粒体探针，溶酶体、酵母菌液泡和其它酸性细胞器的探针Ca2＋，Mg2＋，Zn2＋，Na＋，K＋，Cl－等离子荧光探针pH荧光探针:近中性pH应用的探针，酸性，探针交联物活性氧和一氧化氮探针信号转导探针：蛋白激酶，蛋白磷酸酶和核苷酸结合蛋白探针入胞作用、受体和离子通道探针pH细胞形态和流体测量的荧光示踪剂细胞骨架蛋白荧光探针四荧光生色团的结构特点1天然荧光生色团的结构特点（1）碳原子骨架：分子具有共轭双键体系，大多含有芳香环或杂环任何有利于提高π电子共轭度的结构改变，都将提高荧光效率。例如：对苯基化，间苯基化等。（2）分子的几何排布：具有刚性平面结构COOCOOHHOHHCOCOOHHO荧光素酚酞四荧光生色团的结构特点（4）取代基的位置：邻位、对位—荧光增强，间位—荧光减弱（-CN基例外）(5)环境、溶剂、温度及pH等均会影响分子结构，从而影响荧光四荧光生色团的结构特点（3）取代基的类型：（1）加强荧光的基团：给电子取代基，-NH2,-NHR,-OH,-OR,-CN,-OCH3,-OC2H5（2）减弱荧光的基团：得电子取代基，-CO2H,-COOH,-C=O,-NO2,-NO,-SH,-F,-Cl,-Br,-I（3）影响不明显的基团：-R,-SO3H,-NH32蛋白质和核酸中的荧光生色团Tryptophan(W,Trp)Phenylalanine(F,Phe)Tyrosine(Y,Tyr)四荧光生色团的结构特点生色团条件exnmmax10-3emnmFFns敏感度maxF10-2TrpH2O,pH72805.63480.22.611TyrH2O,pH72741.43030.13.61.4PheH2O,pH72570.22820.046.40.08Y-baseYeast-RNAPhe3201.34600.076.30.91亚硝基奈酚+Tyr茚三酮（Cu2+,pH5.8)+Pheex:460nm,em:570nmex:365nm,em:515nm四荧光生色团的结构特点五影响荧光测量的因素1光化分解（photodissociation）光照后导致化学键断裂——荧光减弱2淬灭(quenching)(1)温度淬灭：温度每升高10C，荧光减少的百分比，称为温度系数。在20-300C的范围内，温度系数大约为1.5。(1)浓度淬灭：21内滤光效应（innerfiltereffect)(3)杂质淬灭：3O21O23溶液pH的影响利用一些物质在不同pH值溶液中荧光强度和颜色的改变，可以判别各种滴定的终点。指示剂颜色变化pH范围萘酚无色变黄绿8.2-10.3荧光素浅绿变绿4.0-5.0丫啶橙浅黄绿变黄8.0-10.04溶液极性的影响荧光物质在非极性溶液中的发射峰位比其在极性溶液中的峰位向短波方向（或高频方向）移动，即蓝移，同时荧光强度前者也高于后者。DPH水溶液中膜中发射波长：440nm发射波长：430nm5溶剂和化学试剂(1)溶剂选择要适宜例如：苯、丙酮、酚在紫外波段有吸收。(2)溶剂要纯6荧光污染(1)涂活塞用的润滑油以及橡皮塞和软木塞(2)去污剂(3)微生物污染(4)滤纸六荧光分光光度术的应用(一）.物质的检测1测量原理：稀溶液，F=I0εcL2结构特点：含有“芳香环”结构3灵敏度：10-7~10-8g/ml检测物质激发波长nm发射波长nm维生素A345490维生素B2，pH7370565维生素B12，pH7275305维生素C4905303,4-苯并芘10-6g/ml3814035羟色胺，中性或弱酸性2953305羟色胺，盐酸295550，330研究生物大分子构象（二）蛋白质的荧光分析1蛋白质的内源荧光2蛋白质的外源荧光（三）核酸的荧光分析１嘌呤及衍生物室温，用紫外和可见光照射，中性水溶液中，均无荧光。酸性介质中，腺嘌呤和鸟嘌呤有荧光。碱性介质中，鸟嘌呤有荧光２嘧啶及衍生物游离的胸腺嘧啶有自发荧光，但量子产率极低Φ＝0.00153核酸的荧光标记ProbesexemNoteEthidiumBromide545610非透膜，RNA,DNAPropidiumIodine530615PO-PRO-1iodine435455AcridineOrange490590透膜，RNA,DNAPyroninY545580Bisbenzimide345460透膜，DNA（四）利用荧光技术检测分子间结合程度1用荧光偏振变化检测结合程度当一些小分子，如辅酶、辅基、半抗原等与特异蛋白质反应时，改变其荧光特性（强度与偏振），通过这些参数的变化，可以了解他们结合时的信息。结合后的大分子驰豫时间长，荧光偏振就大。用杀鼠灵滴定HSAScatchard图r=[L]Ka(n-r)[L]=[L0]–[LP]=[L0]–r[P0]λex=320nmλem=400nm2用荧光强度变化检测结合程度（五）大分子内基团间或分子间距离的测定荧光共振能量转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)荧光共振能量转移的三个条件：供体和受体都能发光供体的发射谱和受体的激发谱必须有部分重叠供体和受体的距离必须小于100ÅForster公式E=R06/(R6+R06)R0:临界距离，E：转移效率，R：基团间距离E=1-IDA/IDIDA:受体存在时的荧光强度，ID：受体不存在时的荧光强度大分子内基团间或分子间距离的测定1膜流动性DPH：P值小，流动性高2-AS，6-AS，9-AS，12-AS高2膜渗漏性羧基荧光素(selfquenching)3膜电位的测量Nernst公式：E(mV)=59log(KO+/KI+)KO+：细胞外浓度，KI+：细胞内浓度荧光探剂：花菁（cyanine)K+载体：缬氨霉素：（六）膜生物物理研究4膜融合机理的研究方法一：利用能量共振转移现象λIλI方法二：利用淬灭现象1/25膜成分扩散速度的测定荧光漂白恢复技术fluorescencerecoveryafterphotobleaching，FRAPD：扩散系数，ω：光斑半径，1/2：漂白后的荧光值恢复到稳定值的一半所需时间，rD：与光斑形状有关的一个常数。常用探剂：标记脂类——DiI标记蛋白——异硫氰荧光素（FITC），蕊香红（rhodamine）D=ω241/2rD（七）荧光技术与其它技术