医学微生物学与免疫学

1医学微生物学与免疫学实验指导（供医疗、护理、口腔、药学等专业用）主编：彭效祥班级：学号：姓名：山东万杰医专微免教研室编制2007年6月12日2目录实验项目一细菌形态及结构观察…………………3实验项目二细菌形态学检查法……………………4实验项目三细菌的分布……………………………6实验项目四细菌的消毒及药敏试验………………7实验项目五血型抗原检测…………………………9实验项目六免疫球蛋白的测定……………………10实验项目七细菌凝集反应…………………………12实验项目八琼脂双扩散试验………………………133实验一细菌形态及结构观察一、实验目的1、熟悉显微镜油镜的使用方法，学生能独立用油镜观察细菌标本。2、认识细菌的基本形态及特殊结构----鞭毛、荚膜、芽胞等。二、实验内容1、显微镜油镜的使用方法及维护2、细菌形态及结构观察三、实验仪器、设备及材料1、显微镜2、标本（鞭毛、荚膜、芽胞、葡萄球菌、链球菌等）四、实验原理细菌较小，肉眼不能直接观察，通过显微镜放大1000倍后观察细菌的形态结构五、实验步骤1、显微镜油镜使用由指导教师讲解、演示、学生自己操作2、细菌的基本形态观察—个人操作个人使用油镜观察细菌中的球菌、杆菌、弧菌等形态标本片。3、细菌的特殊结构观察—示教认真观察示教标本——芽孢、荚膜及鞭毛形态。六、实验报告要求绘出观察到的细菌形态及结构图。七、实验注意事项1、显微镜的正确使用2、避免压碎标本片和损坏镜头4八、思考练习1、如何正确使用显微镜的油镜观察细菌2、绘制出细菌常见的形态与结构实验二细菌形态学检查法一、实验目的1、熟悉细菌涂片的制作。2、掌握革兰氏染色法。二、实验内容1、细菌涂片制作2、革兰氏染色法三、实验仪器、设备及材料1、菌种（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）、取菌环、玻璃片、生理盐水、酒精灯2、搪瓷盆、支架、冲洗瓶、染液（结晶紫或龙胆紫、碘液、95%酒精、稀释复红）四、实验原理1、G+菌细胞壁结构较致密,含脂类少,乙醇不易透入,95%乙醇可使细胞壁脱水,细胞间隙缩小,通透性下降,阻碍结晶紫和碘的复合物渗出;而G-菌的细胞壁结构较疏松,含脂类量多.易被乙醇溶解,致使细胞壁通透性增高,细胞内的结晶紫和碘的复合物易被溶出而脱色.2、G+菌含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不易被脱色，G-菌含核糖核酸镁盐少，易被脱色。3、G+菌等电点（PH2-3）比G-菌等电点（PH4-5）低，在同一PH染色环境中，G+菌比G-菌带的负电荷多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合牢固，不易脱色。5五、实验步骤1、细菌涂片制作—个人操作（1）、取洁净载玻片一张，于中心滴加生理盐水一小滴（2）、用铂金耳以无菌手续取菌少许，涂于生理盐水中，使成1cm2左右微混浊菌液，待干。（3）、将涂片通过火焰三次，固定菌膜即成。2、染色（1）、初染加结晶紫染液于涂片上,染一分钟后,用水洗去染液.（2）、媒染加碘液染一分钟,水洗.（3）、脱色加95%乙醇,不时摇动30秒,至无紫色脱落为止,水洗.（4）、复染加稀释石炭酸复红液一分钟,水洗,干后镜检.六、实验报告要求记录涂片及染色过程及观察结果。七、实验注意事项（1）、染色结果常受操作者技术影响,尤其是容易过度脱色,往往阳性染成阴性.（2）、在同一载玻片上,需用已知金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌作革兰阳性及阴性对照.（3）、染色关键在于涂片与脱色,涂片不宜过厚,固定不宜过热,脱色不宜过度.（4）、菌龄为18～24小时为佳.八、思考练习1、涂片的制作方法及革兰氏染色法的步骤2、革兰氏染色法的意义6实验三细菌的分布一、实验目的1、了解细菌在自然界及正常人体皮肤上的分布情况，树立无菌观念。2、熟悉细菌的培养方法二、实验内容1、细菌在自然界的分布：空气、水、土壤中细菌的培养。2、正常人皮肤细菌培养。三、实验仪器、设备及材料普通固体培养基、取菌环、试管、吸管、恒温培养箱四、实验原理培养基、恒温箱为细菌提供合适的生长繁殖的条件，使细菌能够繁殖，根据菌落的多少来判断空气、水、土壤中细菌和正常人皮肤细菌的多少。五、实验步骤1、细菌在自然界的分布—小组集体操作（1）、空气培养取普通琼脂平板培养基一个，标明班级、小组、实验名称后，敞开培养基在空气中暴露10分钟，盖好后送37ºC培养箱中培养，24小时后看结果。（2）、水培养取普通琼脂平板培养基一个，标明班级、小组、实验名称，以吸管吸取自来水0.1毫升，以无菌手续加入培养基中，再以接种环涂匀，放培养箱培养，24小时后看结果。（3）、土壤培养取普通琼脂平板培养基一个，标明班级、小组、实验名称，再取小试管一支，7加无菌盐水1毫升，取土壤一小粒放入盐水中摇匀，以无菌吸管吸取上清液0.1毫升注入培养基内，再以接种环涂匀，放培养箱培养，24小时后看结果。2、正常人皮肤细菌培养：取普通琼脂平板培养基一个，标明班级、小组、实验名称，小组中找一名同学用任一手指在培养基表面沾几次，放培养箱培养，24小时后看结果。六、实验报告要求记录结果（空气、水、土壤中细菌数的多少，正常人皮肤细菌数的多少）并解释七、实验注意事项1、在操作的过程中尽量减少杂菌的污染2、注意接种环的使用，避免滑破培养基，影响观察八、思考练习1、空气、水、土壤哪个环境中细菌数较多，哪个比较少，为什么？2、人的皮肤表面分布大量细菌的生理意义实验四细菌的消毒及药敏试验一、实验目的1、熟悉常用消毒方法（煮沸、酒精、碘酒、新洁尔灭、过氧乙酸、紫外线等）2、熟悉细菌药敏试验的方法及意义二、实验内容1、常用的消毒试验2、细菌药敏试验8三、实验仪器、设备及材料1、酒精灯、试管、试管夹、酒精、碘酒、新洁尔灭、过氧乙酸、普通琼脂平板培养基、接种环、培养箱、紫外线灯。2、抗生素药敏纸（选用10种）、普通琼脂平板培养基、培养箱、镊子、葡萄球菌与大肠杆菌。四、实验原理1、高温煮沸可以杀死细菌；紫外线可被细菌吸收，妨碍其DNA复制；化学消毒剂可使菌体蛋白变性、破坏酶系统影响其代谢或改变细菌的细胞壁或细胞膜的通透性而杀菌。2、将含有一定量抗菌药物的纸片或药片，平贴于已接种被检细菌的琼脂培养基上，纸片或药片中的药物即呈梯度向周围扩散，敏感菌株在纸片或药片的周围生长受到抑制，而形成抑菌圈。根据抑菌圈的大小，可判断细菌对抗菌药物的敏感性。五、实验步骤1、常用消毒法试验（1）、皮肤消毒试验---小组集体操作取普通琼脂平板培养基一个，以蜡笔于其背面分成4个区，标明标记，然后由四个同学分别操作：第一人以75%酒精消毒食指后，涂抹第一区。第二人以碘酒消毒食指后，涂抹第二区。第三人以0.1%新洁尔灭消毒食指后涂抹第三区。第四人以0.5%过氧乙酸消毒食指后涂抹第四区，作完后送培养箱培养，24小时后看结果。（2）、煮沸消毒试验---小组集体操作①取普通琼脂平板培养基一个，以蜡笔分成两个区，标明标记。9②取试管1支，加自来水约1毫升，以吸管吸取0.1毫升，种入培养基的1/2区内涂匀，剩余的水加热煮沸5分钟，再以无菌吸管吸取0.1毫升，种入培养基的另1/2，涂匀后放培养箱培养，24小时后看结果。（3）、紫外线杀菌试验---小组集体操作①取普通琼脂平板培养基一个，标明标记，以无菌手续接种细菌②开启培养基暴露紫外线杀菌灯下40~50cm处，并以普通纸一张遮盖培养基的一半，照射40分钟后盖好培养基送培养箱培养，24小时后看结果。2、细菌药敏试验---小组集体操作（1）、取普通琼脂平板两个，分别接种葡萄球菌与大肠杆菌（密集划线）。（2）、取抗生素药敏纸（选用10种）分别贴入上述已接种细菌的平板上，37℃培养24小时后观察结果。六、实验报告要求1、记录各实验结果并作出结论2、判断并解释药敏试验的结果，选择出合适的抗生素七、实验注意事项1、注意无菌操作、紫外线灯与培养基的距离2、仔细测量抑菌环大小，抑菌环大小是以测量抑菌环直径为标准来解释。八、思考练习1、常用消毒灭菌法的原理及用途2、药敏试验的临床意义实验五血型抗原检测一、实验目的10熟悉血型鉴定的方法，测知个人血型，了解血型抗原的分布。二、实验内容血型鉴定---自我鉴定三、实验仪器、设备及材料抗A、抗B单克隆抗体，刺血针，酒精，碘酒，棉棒，灭菌玻璃片四、实验原理用已知的抗A、抗B单克隆抗体和人的红细胞表面的A或B抗原结合，根据反应现象判断结果。五、实验步骤1、取洁净玻片一张，于左上角标记“抗A”，右上角标记“抗B”，并分别加抗A与抗B血清一滴于相应区。2、消毒无名指后以刺血针刺血，弃去第一滴，以另一洁净玻片的一角沾血少许涂于抗A侧，再以另一角沾血少许涂于抗B侧，摇匀，1-2分钟看结果，并判定血型。六、实验报告要求记录血型鉴定结果，并说明细胞表面携带ABO血型抗原及血清中所含抗体情况。七、实验（训）注意事项1、注意无菌操作，不要污染刺血针、伤口，以免引起感染。2、取血量不要太多也不要太少，以免影响判断。八、思考练习1、血型检测试验属于哪一类反应？2、你测量的结果是什么？并分析说明11实验六免疫球蛋白的测定一、实验目的了解免疫球蛋白的测定方法，熟悉IgG、IgM、IgA的血清含量情况及正常值。二、实验内容测定病人血清中IgG、IgM、IgA含量。三、实验仪器、设备及材料含抗IgG、抗IgM、抗IgA抗体的琼脂单扩散板、加样器、病人血清四、实验原理小分子的抗原与抗体可在半固体琼脂中扩散。将抗Ig血清均匀地混合于琼脂或琼脂糖胶内，检样中抗原（相应Ig）呈辐射状向含抗体的琼脂内扩散，至抗原与抗体的量达恰当比例时形成可见的沉淀环。沉淀环直径的平方或面积与相应的抗原（IgG、IgA、IgM）含量成正比。五、实验步骤1、取免疫球蛋白测定板（琼脂单扩散板）IgG、IgM、IgA各一个，标明标记。2、用加样器吸取病人血清准确加入各试验孔中（每人加两孔），加满为止，不可过量或不足。3、将测定板放入保湿皿中，置室温24小时后看结果。六、实验报告要求记录各项测定的反应环直径，并计算出含量与正常值对比判定病人血清中免疫球蛋白含量是否正常。七、实验注意事项1、向孔中加血清时，不要滴在孔的外面；加样器的枪头不要碰到孔周围的琼脂，12以免使孔变形，影响结果。2、为避免沉淀环变形，琼脂板要保持水平位置。八、思考练习1、免疫球蛋白的测定属于哪一类免疫反应2、测定结果是否正常，如不正常为什么？实验七凝集反应一、实验目的熟悉试管细菌凝集反应的原理，操作方法及实用意义。二、实验内容试管细菌凝集反应三、实验仪器、设备及材料试管、菌液、吸管、受检血清四、实验原理试管凝集试验是细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体在试管中直接凝集的半定量试验。多用以测定抗体。五、实验步骤见下表13(1)将待检血清进行一系列倍比稀释，并设抗原对照。（2）加一定量的诊断菌液（3）孵育，使细菌和抗体充分反应（置35℃温箱或水浴过夜或56℃水浴2--4小时）（4）观察每个试管内抗原的凝集程度，通常以产生明显凝集现象（2+）的最高血清稀释度为血清中抗体的效价。六、实验报告要求记录实验过程及结果解释。七、实验注意事项1、加样一定要准确2、要有空白对照试验，以防因诊断菌液不稳定发生自凝或电解质浓度及PH不适当可引起非特异性凝集而出现假阳性。八、思考练习1、试管细菌凝集反应的原理2、怎样判断待测血清中抗体的效价？实验八琼脂双扩散试验一、实验目的1、熟悉琼脂双扩散试验方法2、理解AFP检测的原理与意义。二、实验内容琼脂双扩散试验---AFP检测三、实验仪器、设备及材料玻璃片、琼脂、打孔器、烧瓶、电炉、加样器、AFP抗体、不同稀释度的AFP溶液14四、实验原理原理：将抗原和抗体分别置凝胶反应板中自由扩散，当抗原与其对应抗体在凝胶中相遇结合，若两者比例合适便形成沉淀线。五、实验步骤1、制板：取洁净无痕载玻片平放于水平台上，取已融化的1%琼脂，轻轻倾注于玻璃表面，制成琼脂板。注意琼脂不宜太烫易溢出玻片，也不能太冷，太冷易结成凝块。琼脂内不要有气泡。2、打孔：琼脂冷却凝固后，可根据实际需要打孔，常用梅花形，一般孔距3—5mm，孔直径3mm，打孔后用注射针挑去琼脂心。3、加样：中央孔加已知抗体，外围六个孔中分别依次加