RNA测序研究进展

基因组学课程论文RNA测序的研究进展薛璐学号：20094735专业：生物技术班级：生物技术一班论文提交日期2011年10月19日成绩基因组学论文-2-RNA测序的研究进展薛璐（生物技术一班生命科学学院黑龙江大学哈尔滨150080）摘要：继人类基因组计划完成后，RNA又成为分子生物学研究的一个新的热点和焦点，在短短几年内已取得突破性的进展，而在RNA研究进展中，RNA测序技术是最重要的而且是最关键的一项技术，本文详细的介绍了RNA测序的原理和方法，并同时也概括了目前对RNA测序的研究进展，RNA测序在生物研究中占有十分重要地位，RNA测序已成为基因表达和转录组分析新的重要手段。因此随着科学技术的发展，RNA测序技术将会越来越成熟，并显现出重要的作用。关键词：RNA测序研究进展RNAsequencingresearchprogressXuelu(ThefirstclassofBiologicaltechnology,CollegeofLifeScience,HeilongjiangUniversity,Harbin,150080)Abstract：Followingthecompletionofhumangenomeproject,RNAandbecomemolecularbiologyresearchofanewhotspotandfocus,inafewshortyearshasmadebreakthroughprogress,andresearchprogressinRNA,RNAsequencingtechnologyisthemostimportantandthemostisoneofthekeytechnology,thispaperintroducedtheprincipleandmethodofRNAsequencing,andalsotosummarizethecurrentresearchprogressofRNAsequencing,RNAsequencinginthebiologicalresearchholdstheveryimportantposition,theRNAsequencinggeneexpressionandhasbecomeanimportantmeansnewtranscriptomicanalysis.Sowiththedevelopmentofscienceandtechnology,RNAsequencingtechnologieswillmoreandmoremature,andappearimportantrole.Keywords：RNASequencingResearchProgress正文：在生物学研究中，随着新一代高通量DNA测序技术的快速发展，RNA测序(RNA-seq)已成为基因表达和转录组分析新的重要手段，并且随着RNA的重要性逐渐被人所认识，研究人员也开发出多种方法来研究它。1.RNA测序的产生诞生于20世纪70年代的Sanger法是最早被广泛应用的DNA测序技术[7]，也是完成人类基因组计划的基础但是，由于它测序通量低，费时费力，科学家们一直在寻求通量更高速度更快价格更便宜自动化程度更高的测序技术自2005年以来，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序技术相继诞生，新一代测序技术又称作深度测序技术，主要特点是测序通量高，测序时间和成本显著下降。把这种高通量测序技术应用到由mRNA逆转录生成的cDNA上，从而获得来自不同基因的mRNA片段在特定样本中的含量，这就是mRNA测序或mRNA-seq同样原基因组学论文-3-理，各种类型的转录本都可以用深度测序技术进行高通量定量检测，统称作RNA-seq或RNA测序。2.RNA测序的介绍2.1RNA测序的分类目前RNA测序技术主要分为两类，一类是将DNA高通量测序技术应用到由mRNA逆转录生成的cDNA上，从而获得来自不同基因的mRNA片段在特定样本中的含量，各种类型的转录本都可以用深度测序技术进行高通量定量检测。另外一类就是最新的直接测序方法：利用单分子测序技术来进行RNA直接测序。2.1.1第一类第一类的主要代表是Illumina/Solexa测序技术，LifeTechnologies公司在这一技术的基础上也开发出了一种单细胞转录组测序技术，可以用于研究细胞从内细胞团发育成胚胎干细胞时的基因表达变化。Illumina/Solexa新测序技术基本原理是边合成测序(sequencingbysynthesis，SBS)，即测序过程是以DNA单链为模板，在生成互补链时，利用带荧光标记的dNTP发出不同颜色的荧光来确定不同的碱基，新加入dNTP的末端被可逆的保护基团封闭，既保证单次反应只能加入一个碱基，又能在该碱基读取完毕后，将保护基团除去，使得下一个反应可继续进行，为了增加荧光强度，使之更易被成像系统所采集，该技术在测序之前还需要对待测片段做桥式扩增(bridgeamplification)。利用这种技术，研究人员可以展示当细胞发育时基因表达是如何改变的，他们还鉴别出两类看起来负责调控多能性的microRNA，以及似乎在调控发育中起作用的选择性剪接事件。2.1.2第二类随着新一代高通量DNA测序技术的快速发展，RNA测序(RNA-seq)已成为基因表达和转录组分析新的重要手段，并且随着RNA的重要性逐渐被人所认识，研究人员也开发出多种方法来研究它。但是许多方法仍需将RNA反转录成cDNA，而这一步会引入错误，且效率不高。近期一些研究小组开发出了RNA测序新技术。这种新型单分子测序技术在RNA测序领域当属HelicosBioSciences公司，近期他们也发表了一篇验证文章，证明了利用这汇总单分子测序技术能进行RNA直接测序。这个过程不同于之前的技术方法主要是在于能跳过将mRNA逆转录成cDNA这一过程，因此不会出现反转录、扩增、连接以及其他cDNA合成步骤的相关困难，而是能利用极少量的总RNA来综合、无偏见地浏览转录组。并且这种方法还能消除转录组分析偏误，目前这种RNA直接测序方法目前的错误率约为4%，大部分是黑暗碱基（darkbase）引起的缺失，插入的错误率为1-2%，基因组学论文-4-而替换的概率只有0.1-0.3%。但是这种方法中，由于mRNA比较脆弱，操作上也要多加注意。这种方法的技术原理是边合成边测序方法，首先研究人员对一段40个碱基的RNA序列进行测序，来检验这种方法。大约一半（48.5%）的读长是20个核苷酸或更长。最长的无误差读数是38个碱基。随后他们将注意力转向酿酒酵母这种模式生物。因为酿酒酵母的大部分RNA本身就存在聚腺苷酸化，所以她们不需要在测序前再加上poly-A尾巴。研究人员为了让“边合成边测序”的反应适应直接的RNA测序，优化了使用的聚合酶到缓冲液，并利用专利的荧光核苷酸类似物，从而能在poly(dT)包被的表面捕获聚腺苷酸化的RNA，并利用大肠杆菌poly(A)聚合酶I来进行边合成边测序的步骤。目前在HelicosBioSciences公司网站上暂没有看到相关产品的信息，不过相信不久以这种技术为原理的产品将会进入市场。2.1.3两者比较a.第二类新技术可消除转录组分析偏误。了解基因组的功能输出（一个细胞或细胞群中的全部信使RNA，被称为转录组），是生物学研究过程中的一个必要步骤。当前研究转录组的方法依赖于微阵列和测序方法，它们需要合成互补DNA，之后再进行多种操作，这样会引入偏误和潜在的人为结果。研究人员利用单分子测序技术来进行RNA直接测序，这将有助于更为详细地了解有多少基因组被转录、每个基因产生了多少RNA变异。这种转录组分析方法的局限是它需要成百上千的细胞。研究人员为了让“边合成边测序”的反应适应直接的RNA测序，优化了使用的聚合酶到缓冲液，并利用专利的荧光核苷酸类似物，从而能在poly(dT)包被的表面捕获聚腺苷酸化的RNA，并利用大肠杆菌poly(A)聚合酶I来进行边合成边测序的步骤。首先研究人员对一段40个碱基的RNA序列进行测序，来检验这种方法。大约一半（48.5%）的读长是20个核苷酸或更长。最长的无误差读数是38个碱基。随后他们将注意力转向酿酒酵母这种模式生物。因为酿酒酵母的大部分RNA本身就存在聚腺苷酸化，所以她们不需要在测序前再加上poly-A尾巴。在这个实验中，研究小组产生了41261个读数，每个约为20个核苷酸或更长。近一半（48.4%）的读数与酵母基因组配对。90%以上的配对读数是位于已知的酵母开放读码框3’端的400个核苷酸内。实验过程中，研究人员意外地检测到酵母RNA3’端的异质性。她们还发现证据，暗示至少有一些酵母核糖体RNA和小核仁RNA（snoRNA）是聚腺苷酸化的。研究人员称这种RNA直接测序方法目前的错误率约为4%，大部分是黑暗碱基（darkbase）引起的缺失。插入的错误率为1-2%，而替换的概率只有0.1-0.3%。b.高通量RNA测序转录组提供了有关活性基因的功能、调控和互相依赖的信息。最近科学家们将高通量测基因组学论文-5-序仪应用于转录组分析（RNA-Seq），新方法让研究人员能够更为详细地了解有多少基因组被转录、每个基因产生了多少RNA变异。这种转录组分析方法的局限是它需要成百上千的细胞。研究人员将转录组分析方法应用到单个细胞的分析中，并以前所未有的精度分析了取自四细胞胚胎和卵母细胞的单个老鼠细胞的转录组。新方法不仅对发育生物学的研究至关重要，而且也让科学家们能够在胚胎发育的早期深入研究单个细胞中全部基因表达、研究复杂组织中的细胞异质性，并在单个细胞的水平上分析疾病的发展。2.2RNA测序文库制备和测序平台数据输出2.2.1RNA测序文库制备对于mRNA-seq实验，从总RNA到最终的cDNA文库制备完成主要包括以下步骤首先，用Poly(T)寡聚核苷酸从总RNA中抽取全部带Poly(A)尾的RNA，其中的主要部分就是编码基因所转录的mRNA将所得RNA随机打断成片段，再用随机引物和逆转录酶从RNA片段合成cDNA片段然后，对cDNA片段进行末端修复并连接测序接头(adapter)，得到将用于测序的cDNA在以上过程，将RNA随机片段化和采用随机引物进行反转录，都是为了使所得cDNA片段较均匀地取自各个转录本为提高测序效率，一般还需要用电泳切胶法获取长度范围在200bp(25bp)的cDNA片段，再通过RCR扩增，得到最终的cDNA文库.在上述文库制备过程中，如果不是只抽取带Poly(A)尾的RNA，而是使用全部的RNA，则RNA-seq测得的就是细胞中的全部转录本，如果把带Poly(A)尾的RNA过滤掉，也可以得到非编码的RNA转录本，如果从总RNA中只提取长度为2123个碱基左右的RNA，则得到全部的miRNA(microRNA)转录本,相应的方法也称作miRNA-seq.样品制备最终得到的是双链cDNA文库在后续测序中，测得的每个读段(read)随机地来自双链cDNA的某一条链，从读段序列本身无法得知它是与RNA方向相同还是倒转互补，在后续的读段定时需要两个方向都考虑在新基因识别等应用中，转录本的方向对基因注释尤为重要，需要在文库制备和测序中保留RNA的方向信息最近有文献报道了保留方向信息的RNA-seq样品制备方法.2.2.2测序平台数据输出将RNA-seq测序文库加入流动槽(flowcell)中的各通道(lane)，在桥式PCR扩增后，就可以进行测序了测序过程中，计算机软件同步地对荧光图像数据进行处理，通过分析荧光信号来确定被测碱基，并给出质量评分按照图像上的位置坐标，计算机程序将同一位置测得的碱基根据测序顺序连成读段(read)由于荧光图像文件所占有的磁盘空间很大，通常GAIIx平台一次实验就能产生上太字节(TB)的图像文件，所以一般情况下不予保留原始基因组学论文-6-的荧光图像数据，而是只保留程序读出的读段数据及对应的质量分值，这就是