RNA的提取和cDNA合成与realtimePCR-100125

RNA的提取，cDNA合成及realtimePCR一：RNA提取1．RNA提取中应该注意的事项模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等，许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。本实验室采用Trizol®试剂进行总RNA的提取，纯化的mRNA在70%乙醇中-80℃可保存一年以上。2．RNA提取所需要准备的试剂及器材1）试剂三氯甲烷、异丙醇、DEPC水（配制方法参考分子克隆）、75%乙醇（用经DEPC处理的去离子水配制）2）设备及器材真空泵、分光光度计、匀浆器（用于组织来源的样本）、冰浴、RNase-free的eppendorf管、RNase-free的枪头、一次性手套、一次性口罩、一次性帽子。3．RNA提取的步骤3．1细胞在Trizol®试剂中的匀质化此步骤因样本类型的不同在操作上略有不同，请操作者依据情况而定。a.组织样本将事先经180℃干烤过夜的匀浆器置于冰浴中，加入1mlTrizol®液，然后将新鲜取得的或保存于液氮中的组织块50-100mg（注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%），经生理盐水清洗后迅速置于Trizol®液中，仔细研磨，直到形成均一的混合液，整个操作在冰上进行。b.单层贴壁细胞将培养皿中的细胞培养液吸干，直接在培养皿中加入适当体积的Trizol®液（1ml/10cm2），Trizol®液的不足会造成DNA的污染。用枪吸打混合液数次，直到形成均一的混合液，无粘稠现象。c.悬浮细胞或RNA提取cDNA合成realtimePCRRT-PCR首先通过离心收集细胞。用PBS清洗细胞两次，除去上清后加入适当体积的Trizol®液（1ml/5-10×106细胞）。用枪吸打混合液数次，直到形成均一的混合液，无粘稠现象。注意：当样品中混有较多的蛋白、多糖、脂肪或者肌肉组织的时候，需要进行额外的一个分离步骤。在细胞与Trizol®充分混合均匀后，在2-8℃，12000g离心10min，抽取上清到一个新的EP管，以除去不溶性的物质。然后再新的EP管中进行以下步骤。注：放在Trizol®中的RNA可放于-80℃冰箱中保存，长达半年。在样品数目较多，或者不同时间点收集的样品一时无法完成RNA提取的全部操作程序，可以考虑选择这样的方式保存。3．2氯仿（三氯甲烷）抽提将上述获得的Trizol®混合液在室温放置5min，使核蛋白复合物充分解的离。按照200ul/1mlTrizol®的比例加入三氯甲烷，用力摇匀15-30s，室温静置2-3min。用不大于12000g的转速2-8℃离心15min。离心后，Trizol®混合液会分为三层：下层为粉红色的有机相，中间层为薄薄的白色物质，上层为清亮的水相，只含有RNA，大约占60%。3．3RNA沉淀将水相小心的转移到一个新的EP管中（注意不要碰到中间相），如果要进行DNA和蛋白的分离可保存有机相（操作按照Trizol®说明书进行）。加入吸出的RNA水相等体积的异丙醇，均匀混合后，室温静置10min，然后用不大于12000g的转速2-8℃离心10min。注：异丙醇按照1：1的量加入。异丙醇沉淀中含有较多的盐离子，沉淀后要用75%乙醇漂洗，见下。3．4RNA沉淀的漂洗将上清部分去除，加入至少1ml的75%乙醇（用经DEPC处理的去离子水配制），用振荡器振荡使RNA沉淀重悬，使RNA沉淀得到充分漂洗。然后用不大于7500g的转速2-8℃离心5min。3．5RNA沉淀的溶解去除上清，室温干燥5-10min，可用一次性手套盖住管口，以防RNA降解。另外注意不要使RNA沉淀过干，影响RNA的溶解。用适当体积的DEPC水溶解RNA沉淀，可将EP管放到55℃水浴中促进RNA的溶解。注：根据RNA沉淀大小适量调整DEPC水的体积，使RNA浓度尽量一致。3．6RNA质量的检测及浓度测定。电泳检测：用1%的琼脂糖电泳观察RNA质量。总RNA由rRNA，tRNA和mRNA组成，三者分别占总RNA的80%，10～20%，3～5%。28SrRNA和18SrRNA构成电泳的两条主带，带型清晰，大小分别在2kb和1kb左右；mRNA大小从数百bp到数kb不等，5SrRNA和tRNA更小，这几种RNA亮度较弱。RNA有降解时，28S和18S的主带消失，RNA降解为小分子的片段，电泳时成糜散样分布。见图。分光光度计检测：1）根据OD260计算RNA浓度：RNA的浓度（ng/ul）=(OD260*40ng/ul)*稀释倍数。2)根据OD260/280检测是否有DNA和蛋白污染：RNA的比值为2.0，而DNA和蛋白质的比值为1.8，若比值较低，说明有残余蛋白质和基因组DNA存在；比值太高，则提示RNA有降解（实际做实验时，OD260/280一般在1.3～1.4左右，因此该项的参考意义不大。比值在较文献所述值偏低的原因可能与DEPC水有关）。3）根据OD260/230检测是否有污染：有机物如酚和Trizol试剂中含有的硫氰酸胍在OD230有吸收峰，使得OD260/230比值偏低，这些物质会影响下游如RT-PCR的反应，降低反应效率，特别是在表达谱芯片时，影响较大，因此要注意该项比值，不要太低，理想值为2.0以上。3．7RNA的保存RNA可在DEPC水中于-80℃进行短期保存，不超过1个月。二：RT-PCR1.试剂：Randomprimer（Takara，D3801，用DEPC水溶解成100uM,分装，放于-20度）或oligodT(Takara，D510或D511)，dNTP（Takara，D2030，2.5mMeach，RNA专用）,RNaseinhibitor（Takara，D2313A），M-MuLVReverseTranscriptase（NEB，M0253，若需反转录的区域的GC含量较高，可使用invitrogen公司的superscriptase-反转录温度可达55度，或thermoscriptase-反转录温度可达65度）。2.RT反应体系（第一步）：Random引物（100uM）1μldNTP（2.5mMeach）4μlRNaseinhibitor（40U/ul）0.5μlRNA2ug水补充至17.2570℃5分钟使RNA充分变性，然后立即放入冰浴利于引物与模板的结合。RT反应体系（第二步）：10×RT缓冲液（如有不溶物，可置于55度充分溶解）2μlM-MLMV逆转录酶0.25μl1)（可选）25～30度10分钟。该步骤是使randomprimer与模板结合后先有一个短暂扩增，生成一个较长长度的引物以便于下一步42度时结合更牢固。2)42℃1～1.5小时3)94℃5分钟4)cDNA保存于4℃一个月或-20℃或进行PCR。3.注意事项：微量加样一定要加准（枪，操作细节：各样品之间操作统一，一致）。RT-PCR之前进行电泳分析RNA完整性。试剂溶解时尽量用DEPC水溶解，以防RNA酶污染。三、RealtimePCR1.引物设计与检验1.1引物设计：引物不能有非特异的扩增条带或者引物二聚体在mRNAlevelassay中，要使引物扩增产物尽量的跨过内含子；如果是在不能找到跨内含子的引物，那就要尽量保证RNA的质量要好，没有基因组污染。或者也可以用DNA酶处理逆转录之前的RNA样品。在基因组数据库中用扩增产物BLAST,避免扩增出基因组上的假基因扩增产物尽量小，扩增效率要好；扩增产物在50bp~150bp之间，文献中小于300bp似乎也可以接受根据所选择的试剂，确定退火温度，通常用60度，采用两步法PCR引物设计软件，推荐：ABI公司的PrimerExpress2引物大规模使用之前要先用定量的试剂试用，确保无非特异扩增和无二聚体形成1.2引物检验进行realtimePCR,通过熔解曲线实验判断引物是否可用。2.试剂：试剂盒有多种可选用，实验室所用为TakaraSYBR®PremixExTaq™(PerfectRealTime)，货号DRR041。3.实验步骤3.1反应体系：buffer（2x，含有buffer，dNTP，酶）10ul引物（上下游引物各5uMeach）1ul模板（20ul反转录完成后稀释到100ul）2ulH2O补至20ul3.2配制反应体系，尽量使用premix然后进行分装。上机进行realtime实验。设定程序，不同试剂，不同机子程序不同。另外，由于每次扩增的模板以及其他情况不同，最好每次进行realtime时均作溶解曲线实验确定引物扩增出的为单峰。3.3分析溶解曲线，去掉溶解曲线不佳的孔，标记各孔模板以及基因，选择对数扩增期确定各孔Ct值进行数据分析。4.注意事项：仔细阅读所使用试剂的说明书，按照所使用的机器和试剂选择PassiveReferenceROXDye。ABI7500必须使用Rox，而BioradIQ5不需要。微量加样一定要加准（枪，操作细节：各样品之间操作统一，一致）。拿管和盖时带一次性PE手套，避免干扰管和盖的透光部分。管盖是读数的通道，所以不能写字，如果使用八连管可以在管子的侧边写字编号标注，防止离心时分辨不清。设计PCR管的布局，可以在实验记录上预先写好，方便加样。充分混匀，分至三个复孔。Vortex（转速不至太高，普通离心机不超过3000~5000rpm以避免酶失活）甩至管底，多甩几次去除气泡。放至realtime机子内一定要将管子压紧，压实。进行定量分析舍弃数值差异太大的孔不同次realtimePCR的数值能否相互比较？可以，导出每次的数据进行分析在模板较少时，复孔间的Ct值会有较大的变异，因此标准差会相对较大。分析完之后一定注意保存文件。