PCR-操作

RT-qPCR步骤组织取材：各组大鼠分别于造模后6d、12d、18d断头处死，冰上取大鼠脊髓L4-6，PBS液洗净，置液氮内冻存1个小时以上，-80℃保存。总RNA提取准备工作1)试剂和材料：无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、1.5mlEppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）(管盖与管壁都需标记样品名称)2)75％乙醇、Trizol、氯仿、异丙醇预冷。3)手套：取RNase-free的物品时必须戴手套。4)擦洗取液器：DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部。5)试验前将生物安全柜UV及标本处理间UV打开照射30分钟。操作步骤(所有操作均在冰上进行)1)加Trizol和样本到1.5mlEP管：组织：(剪取米粒大小)加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml。将培养皿中的培养液彻底洗干净，将1mlTrizo直接加在培养皿中的细胞上。悬浮细胞：可直接收集、裂解，每1mlTrizol可裂解5×106动物。800g离心10min后彻底弃上清。加入1mlTrizolReagent，立即用移液器抽打5次。2)离心：12,000rpm离心5min，弃沉淀。3)氯仿：按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。4)离心：4℃12,000g离心15min。5)取上清：吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。6)异丙醇：按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。7)离心：4℃12,000g离心10min。8)弃上清：RNA沉于管底。9)75%乙醇（2遍）：按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。10)离心：4℃8,000g离心5min，尽量弃去上清，保证上清五残留。11)晾干：室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。12)溶解：可用10-50ulDEPCH2O（注：DEPC水的量根据提取RNA的白色沉淀的量决定），TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA样品65℃,5-10min。注：H2O、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。1)测O.D值定量RNA浓度。取待测RNA样品1μl，滴至孔上。注：此方法提取RNAA260/A280值在1.9-2.0之间；产率估计：组织标本：（ugRNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ugRNA/106Cell）：5-15ug。2)-80度保存逆转录（mRNA到cDNA）准备试剂新鲜提取备用的总RNA：特异性PCR引物：上海生工公司第一链cDNA合成试剂盒：ThermoScientificMaximaFirstStrandcDNASynthesisKitforRT-qPCR荧光试剂盒：LightCycler®480SYBRGreenIMaster第一链cDNA合成（说明书）解冻后，混合和简单离心试剂盒的组成部分。储存在冰上。1.按照指定的顺序，将以下试剂加入一个无菌去酶的冰上预冷的EP管：（加1空白对照）2.可选择的。如果RNA模板富含GC或包括二级结构，轻轻混匀，简单离心。在PCR仪上，65°C孵育5分钟。迅速放入冰上骤冷5min。在PCR管较少的时候，建议在PCR仪四角分别放置一个统一规格的PCR管，以平衡热盖压力。3.按照指定的顺序加入下列成分：若样品较多，先配置mix再分装各管，轻轻混匀，简单离心，切勿涡旋震荡。5.对于oligo(dT)18或基因特异性引物合成CDNA，在42°C孵育60分钟。对于随机六聚体引物的合成，在25°C孵育5分钟，随后在42°C孵育60分钟。注：对于富含GC的RNA模板，反应温度可提高到45°C.6.通过在70°C加热5分钟，终止反应。7.逆转录反应产品可以直接用于PCR反应，无需进行纯化。20μl的PCR反应体系可取2-5μlcDNA反应产物进行扩增。2℃-8℃存放1-2h；或-20°C少于一周；对于更长的储存，推荐-70°C。qPCR基因名片网-（genecards.org）提供各种基因的详细介绍第一链CDNA的PCR扩增。冰上操作，保持避光。总体系最初50计算20取整说明书SYBmaster32.5131310上游引物F10.40.51下游引物R10.40.51PCR级水13.55.453cDNA模板20.815合计502020201.计算孔数+2。（每样本分入3复孔）。对照不加模板，而加水。2.配模板混合物：根据RNA定量结果，稀释到1。3.配引物总量混合物（0.5EP）。使用PCR引物的最终浓度0.2到1μm。推荐起始浓度为0.5μm。4.配SYBR混合物（1.5EP）。5.按20ul/孔,分装至96孔板。6.依次加，模板，引物，荧光。96孔板布局对照组处理组1水BDNF孔1BDNF孔1阳性对照孔1BDNF孔2BDNF孔2阳性对照孔2BDNF孔3BDNF孔3阳性对照孔3actin孔1actin孔1阴性对照孔1actin孔2actin孔2阴性对照孔2actin孔3actin孔3阴性对照孔3封板膜。每孔四周压紧。室温1500g离心2min上机。PCR程序设定，反应条件如下：ExperimentalProtocol样品编辑与结果计算：以β-actin作为内参照，检测每个反应管内荧光强度达到设定域值时所经历的循环数(即Ct值)，mRNA的相对表达水平用2-ΔCT进行计算。mRNA相对表达量=2-ΔCTx100％；ΔCt=目标基因CT值一内参(B-actin)CT值。