PCR引物设计(以p53基因为例)

p53基因引物设计临床八年1305班冯昊CONTENTS目录Part1引物设计原则Part2获取目的基因Part3引物设计引物的设计原则设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率PARTONE12引物长度一般引物长度为18~30碱基。决定引物熔解温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。长度越长，Tm值越大。长度过长，退火温度和延长温度相差太小，不利于延伸反应。长度过短，特异性低GC含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴引物设计原则3引物自身和引物之间引物自身不应形成二级结构（如发夹结构）引物设计原则引物之间不能形成二聚体（包括同种引物之间或上游引物与下游引物之间）且引物不能与DNA其他区域错配引物设计原则4引物末端引物3′端：由于延伸从3′端开始，因而不能进行任何修饰；同时不应选择A，因为A-A、A-G错配。3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发引物5′端：主要限定引物长度，对扩增特异性影响不大；可以修饰，如添加限制性内切酶位点，将PCR产物亚克隆引物设计原则引物5′端修饰技术附加核酸序列用途限制酶位点克隆（如定向克隆）噬菌体启动子合成RNA探针、测序蛋白质结合序列产物纯化、检测核糖体结合序列高效表达加错配碱基造成突变定点诱变5避开靶基因的二级结构区PARTTWO获取目的基因利用Genbank数据库搜寻DNA、mRNA或者蛋白质序列来设计引物获取目的基因对应DNA序列蛋白质一级结构蛋白质编码区外显子对应的DNA序列、基因、编号单击CDS后PARTTHREE引物设计利用生物软件和网页进行引物的设计和评价引物设计Primerpremier5最常用的引物设计软件Oligo7常和PP5联用评估引物NCBIPrimer-blast近几年NCBI推出的网站此区域输入待测DNA序列上游引物下游引物引物设计结果（一例）引物与DNA结合情况RT-PCR由于后面要应用于RT-PCR，复制的是cDNA，而cDNA中没有内含子，所以在设计引物时应该用编码区结果：简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。简并引物M--ACS--GCW--ATR--GAY--TCK--GTB--GTCD--GATH--ACTV--GCAN--AGCTThanks