PCR检验

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的TaqDNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。荧光定量PCR技术检测的报告形式一，拷贝数的意义：表示原始标本内可供探针结合的核酸片段数量二，拷贝数与病原体的关系：拷贝数与病原体的数量成正相关三，报告形式：1如果标本量是可以定量的，如血液等，则检测结果报告为：IU/ml(可溯源到国际标准物质的标准品)如HBV-DNA：检测下限：100IU/毫升即：1.00E+02IU/ml如果标本不能定量，如痰液，分泌物等，则结果只能报：copies/毎测试荧光定量PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知的起始模板进行定量分析的方法。Ct值得意义扩增越靠后定量的重复性就越差--扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而产生不可控的影响，偏离线性--在Ct值处重复性非常好--荧光定量技术要求在低浓度进行荧光定量PCR在临床中的应用一,感染性疾病1，肝炎病毒定量检测2，结核杆菌及呼吸道病原体检测3，优生优育（TORCH）相关项目检测4，性病病原体检测5，手足口病相关病毒EV71，柯萨奇病毒的检测二，肿瘤个体化诊断与治疗三，遗传性疾病四，疾病风险评估乙型肝炎病毒（HepatitisB）HBV基因分型与CHB（临床遗传性疾病）的关系全基因组测序HBV可分为A.B.C.D.E.F.G.H8个基因型HBV基因型--HBV基因型与病毒复制及病毒标志物表达的关系--HBV基因型临床疾病谱及疾病预后的关系--HBV基因型与抗病毒疗效之间有关系血清学指标（-）不能排除HBV感染HBeAg(-)/HBV-DNA(+)编码e抗原的preC区基因极易出现变异，在preC区出现终止密码子，在preC区基因与C区基因不能转译出完整的e抗原。导致HBeAg表达缺失，机体感染HBV不表达HBeAg，当然血清学方法也不能检测出HBeAg的存在。HBV基因型---HBV基因型临床疾病谱及疾病预后的关系--HBV基因型是影响慢性乙型肝炎的临床转归的主要决定因素之一。--HBV感染的临床转归一方面决定于患者的年龄和免疫能力，另一方面与基因型种类密切相关。在B,C为优势地区，C型具有较强的疾病能力，预后差；在以A,D为优势的地区，D型具有较强的致病性，肝病严重，预后不良；基因型C在乙肝后肝硬化的发病中起一定的作用，然而基因型B与年轻无肝硬化患者肝癌的发生有关。HBV基因型与抗病毒疗效之间有关系--干扰素抗病毒疗效与HBV基因型有一定的相关性，基因C和D对干扰素的治疗反应比基因型A和B要差（HBV基因型与病毒复制与清除。病毒变异.临床表现.治疗应答和预后均有关系，提示不同基因型具有不的致病性）HBVDNA与疾病的诊断HBVDNA与乙肝”两对半“---”两对半”：机体的免疫反应状态，为间接指标----HBVDNA是乙肝病毒的遗传物质，是病毒存在和复制的最可靠，最直接的指标。----“携带者”，“大三阳”，“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。“大三阳”与HBV-DNA：“HBsAg（+）HBeAg（+）HBcAb（+）”提示患者体内HBV-DNA呈活动性复制，传染性强，荧光定量PCR方法检测HBV-DNA阳性检出率大于80-90%，且病毒载量10的六次方IU/ml“小三阳”与HBV-DNA：“HBsAg（+）HBeAb（+）HBcAb（+）”，HBV-DNA阳性率为40-80%左右，且病毒载量10的六次方IU/ml。一般情况下HBeAb（+）表明HBV复制处于较低水平并可能和宿主DNA发生整合，导致含量较低，应进行HBV-DNA定量检测。常规结核病实验室诊断方法及不足--细胞培养“金标准”,周期长--痰涂片作抗酸染色：灵敏度差，检出率《30%。特异性差，无法将结核杆菌和其他分枝杆菌区分开--血清学诊断：交叉反应，假阳性FQ-PCR诊断结核的关键点--痰液，肺及支气管灌洗液--肺结核--血液-播散性结核和各脏器的结核病--脑脊液-中枢神经系统结核病--宫颈拭子，尿道拭子-泌尿生殖系统结核病--胸水-结核性胸膜炎--腹水-结核性腹膜炎HCV的基因型/亚型{6个型，68个亚型}-1a,b,c,d,e,f,g,h,i,j,k,l,m-2a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,l,m-3a,b,c,d,e,f,g,h,i,k,-4a,c,d,e,f,g,h,k,l,m,n,o,p,q,r,s,t-5a-6a,b,d,f,g,h,i,j,k,l,m,n中国亚型1b（66%），2a（14%），对抗病毒治疗应答不同，因此治疗方案不同。HCV的基因耐药突变特异基因靶向治疗（小分子抑制物）中靶点编码区的耐药--HCV蛋白酶（NS3-4A）--RNV酶（NS5b）HCV的基因型与药物治疗--现知欧美国家多数HCV-1型感染，而亚洲国家以2型为主，三型次之--三型感染临床症状较重，有引起严重肝病的倾向--1b型感染对干扰素治疗不敏感，效果差，2a型感染用干扰素治疗效果好。HCVRNA定量的临床意义？？？？TORCH感染特点--母婴传播的主要病原体--引起胎儿畸形新生儿缺陷的重要原因--自然状态下呈隐性感染--怀孕，多次输血，AIDS等易发生显性感染--可致多发性，全身性感染--只有风疹可获得长久的免疫力，可用疫苗预防TORCH相关病原体检测-弓形虫（TOX）-风疹病毒（RV）-人巨细胞病毒（HCMV）-单纯疱疹病毒（HSV-2）基因检测与预测医学基因检测使预测医学称为可能。疾病分险基因，易感基因的检测，不同人群差异基因的检测，可以全面评估个体对相关疾病的患病风险，从而预测疾病的发生，早期干预，预防。结核杆菌与呼吸道病原体检测--结核杆菌（TB）--EB病毒（EBV）--肺炎衣原体（CP）--肺炎支原体（MP）常见性传播病原体检测-淋球菌（NGH）-沙眼衣原体（CT）-解脲支原体（UU）-梅毒螺旋体（TP）-单纯疱疹病毒（HSV）-乳头瘤病毒（HPV）-人类免疫缺陷病毒（HIV）