SUR1过表达实验设计方案

SUR1过表达实验设计方案一实验目的：使SUR1基因在植物体内超表达二实验方法：三实验步骤①RT-PCR将RNA反转录成CDNARNA提取（-70℃保存）1.组织剪碎加入1mlTrizol，冰上匀浆（边匀浆边暂停）2.转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min3.加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min4.10000rpm4℃离心15min5.转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min6.12000rpm4℃离心15min7.倒掉上清，加1ml75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，10000rpm4℃离心5min8.倒掉上清，室温或37℃放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥9.加20ulDEPC水至EP管中10.在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解逆转录以Fernentas试剂盒为例，反应体系20ul1.RNA短暂离心2.将11ul的DEPC水和RNA（1ug）放入EP管内，置于冰上，使RNA终浓度为0.5ug/ul,再加入Oligo(dt)1ul,轻轻混合均匀，短时间离心(RNA=1/总RNA浓度=1/OD260×6；DEPC水=11-RNA)3.将反应液置于65℃5min冰上1min,短时间离心4.按顺序加入：5×buffer4ul200ul核糖核苷酸酶抑制剂1ul10mmdNTPMIX2ulM-Mulu逆转录酶1ul轻轻混合均匀，短时间离心5.将混合物置于42℃，60min6.70℃加热5min,中止上述反应，置于冰上②据序列设计引物对CDNA进行PCR扩增在TAIR上查出SUR1的序列1ATGAGCGAAGAACAACCACACGCCAATCTAGCGGTTCCCGCGTTTAAAAC51TGAGAAAGAGCCCATAACGCAAACACGAAATGGTCAAAGTAGCGTTTGGC101GTTTCGGTGGAAGTGATAAGGCAGCGAAAGCATCCACCGTAACGCTTAGA151GGTGTCATCTACATGCTCTTCGACAACTGCGGCAAAGACGTCAATAAGAC201CATTTTACCCCTCGGCCACGGTGACCCTTCCGTCTACCCTTGCTTCCGTA251CCTGTATCGAAGCTGAAGACGCCGTCGTCGACGTCCTTCGCTCCGGCAAA301GGCAATTCTTACGGTCCCGGAGCTGGGATTCTCCCCGCAAGACGAGCCGT351TGCTGATTATATGAACCGAGATCTTCCGCACAAGTTAACGCCTGAAGATA401TTTTTCTGACCGCTGGATGCAACCAAGGGATAGAGATCGTGTTCGAATCG451TTGGCTCGACCAAACGCAAACATCTTGCTCCCACGTCCTGGCTTCCCTCA501CTACGACGCTCGTGCTGCTTACAGTGGTCTCGAGGTTCGCAAGTTTGATC551TTCTTCCCGAGAAAGAATGGGAGATTGATCTTGAAGGTATCGAAGCCATT601GCAGACGAGAACACTGTGGCTATGGTTGTAATTAACCCCAACAATCCCTG651TGGAAATGTCTACTCTCACGACCATCTCAAAAAGGTTGCAGAGACGGCTA701GGAAGCTCGGGATAATGGTGATCTCAGACGAAGTATATGACCGAACTATA751TTCGGAGACAATCCATTTGTTTCAATGGGGAAGTTTGCTTCGATAGTCCC801TGTATTGACACTAGCAGGCATATCTAAGGGATGGGTTGTTCCTGGATGGA851AAATTGGCTGGATCGCCTTGAATGATCCCGAGGGCGTTTTCGAGACCACC901AAGGTGTTACAATCCATCAAACAGAATCTTGACGTAACTCCTGACCCTGC951CACAATAATTCAGGCTGCACTTCCAGCGATCCTGGAGAAAGCGGACAAAA1001ACTTCTTTGCAAAGAAGAACAAGATACTCAAACATAATGTTGATTTGGTG1051TGTGATAGGCTCAAGGACATCCCCTGTGTCGTCTGTCCCAAGAAACCTGA1101GTCTTGCACTTACTTATTGACAAAGTTGGAGCTGTCATTGATGGATAATA1151TCAAGGACGATATAGATTTTTGCGTAAAACTGGCCAGAGAGGAGAATCTC1201GTGTTTCTACCAGGGGATGCTCTGGGTTTGAAGAACTGGATGAGGATAAC1251CATCGGAGTCGAAGCTCATATGCTTGAGGATGCACTTGAGAGACTGAAGG1301GTTTCTGTACACGTCATGCCAAGAAGACAGAGACAGAAACTGAGTCACTT1351CAAGCTTTGAAACTGAGTGATAATAATCTCGAAATGTAA根据引物设计原则，利用软件Primerpremier5.0设计上下游引物进行PCR扩增得到目的基因SUR1③载体的构建图1：过表达载体User载体的连接User酶：1ul载体：1ulPCR产物：10ul将混匀的产物于37℃放置25min,再25℃放置25min，完成后加入感受态大肠杆菌中。大肠杆菌感受态转化LB培养基（1L）：蛋白胨10g酵母提取物（Yest）5gNaCl5g固体LB：0.75g琼脂/50ml高压灭菌14min感受态转化：1.-70℃取感受态，冰上融化在超净台中加入载体2.冰上静止30min，42℃水浴热激90s，冰置90s,42℃水浴30s3.在超净台中加入800ul液体LB，37℃，100r/m1h，活化菌4.准备涂菌用的平板，融化固体LB，不烫手时加入选择抗生素，迅速摇匀并倒平板，冷却至凝固5.将活化后的菌4000r/m离心沉淀，其大部分上清，剩约100ul重悬，用移液枪吹起菌体，转移到平板上6.烧涂布棒，前端放在平板盖内侧冷却后，将菌液均匀涂布在平板上，封上封口膜7.培养箱37℃倒置培养12~16h8.菌落PCR鉴定（50mlLB中加入50ul卡那霉素）④测序测序与已知序列一致进行下一步⑤转化农杆菌重组表达载体导人农杆菌。用电转化法将重组表达载体导入农杆菌感受态细胞中，电转化参数为：电压2500kV／em；电容25F；电阻500Q。电击3～5ms后，取出电击杯，迅速加入800L的LB液体培养基，混匀并转移至1．5mL的EP管中，在28℃震荡培养3h；取100／,L菌液涂布于含Gen(50／,g／mL)和Kan(50／,g／mL)的LB平板中28℃培养24h，即可长出阳性克隆。阳性克隆的菌落PCR与酶切鉴定。随机挑取单菌落，在装有1mL的LB和1．5mL的抗生素的离心管中28℃培养12h左右。取5OL培养物，煮沸5rain，5000r／rain离心2min，取1～2／,L上清进行PCR扩增后电泳检测。选取菌落PCR验证后的菌液抽提质粒，并用BstE1I和Bgl1I双酶切后，电泳检测。⑥农杆菌浸染法侵染拟南芥前期准备：取150ml含相应抗生素的液体LB培养基，接入2-3ml准备好的农杆菌菌液，大摇过夜至培养基由红色转为黄色。将培养后的150ul农杆菌菌液导入灭过菌的50ml离心管中，4℃，3000rmp离心15min弃上清，加入50ml1／2MS，将菌泥搅起。用于侵染的1／2MS配方：（每150ml菌液加50ml1／2MS液）MS大量5ml蔗糖10g水95ml表面活性剂20ul常用1／2MS配方（1L）：10X大量元素50ml100X微量元素5ml100X铁盐5ml蔗糖（1%）10g琼脂粉8g拟南芥生长土壤：腐殖土：蛭石=1:1混匀，装双层袋子，高压121℃灭菌40分钟注意：灭完菌后要加适量水将土和湿，不能太湿，然后土装入钵里压实，将钵放入装有水的底盘中，一个小时左右钵中土壤浸湿后便能种苗。种子消毒：30%H2O2+85%乙醇1:4混合取250微升混合液加入种子种用枪头吹打40S，放在滤纸上晾干，然后铺在1／2MS平板上。4℃冰箱中放置春花1-5天，一般新种子春花时间长点。16\8光周期，待真叶长出时，用镊子将苗从平板移植到土壤中。后续操作1种植健康的拟南芥直到开花。在种子种下后浇水盖膜，盖膜的目的是为了保持水分。移栽拟南芥后还需要盖3到4天的膜。2初次开花时将花蕾剪掉以促进更多花枝的增生，修剪后越4至5天可使用，这样优化后的植物含有很多未成熟的花序并没有很多受精的角果，以保证大多数植物被成功的转化。3准备携带目的基因在双元载体（双元载体有两套筛选引子，菌体中用一种，植物中用一种）里的农杆菌菌株。养殖在一个大的液体LB培养基中，培养基带有抗生素，以为筛选二元质粒。4摇床摇农杆菌，用5%的蔗糖溶液（蔗糖溶液中加入表明活性剂，达到浓度0.05%）混悬到OD600=0.8（左右）把100ml的5﹪的蔗糖悬浮的菌液倒入大皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去侵染2分钟，侵染的过程要转动钵子，（侵染之前一晚上最好给钵子里浇些水，以免第二天侵染后钵子里的土容易掉出来），侵染后用滤纸擦干。5侵染后的拟南芥用黑色塑料袋或者薄膜覆盖，暗培养24小时后继续光照。侵染后悉心照料，保持水分充足。一周后可再侵染一次，这是由于拟南芥的盛花期较长，一般要侵染2—3次。6浇水松土正常养殖，种子成熟后停止浇水。7角果自然开裂后收获干燥的种子，独立分装备用。筛选Basta筛选转基因拟南芥收获后的干燥种子经表面消毒，放于4℃冰箱，春化4天后，播种于培养土中，待长出2片真叶后，喷洒1：1000的Basta除草剂进行筛选。设计特性引物，采用RT_PcR方法对具有Basta抗性的拟南芥转基因植株进行鉴定。⑥分子检测收获种子进行自交，在T2或T3代进行分子检测采用半定量PCR的方法6.1总RNA的提取：同第一步6.2基因组DNA的去除RNA样品中痕量的基因组DNA的去除方法参照DNaseI(RNaseFree)试剂说明书进行。对除去基因组DNA的总RNA样品稀释后测定DD260nm和0D280nm，计算RNA的浓度。对初提及去除基因组DNA的总RNA样品各取5μl，2％琼脂糖凝胶，110v电压，l0min电泳后拍照。6.3第一条链cDNA合成①冰上按以下次序配置体系TotalRNA0.1ng-5μgPrimer(randomhexamerprimer)1μLWater,nuclease-free合计12μL②将体系轻柔混合短暂离心后，在PCR仪进行以下程序：65℃，5min后4℃，5min；③顺次加5×Reactionbuffer4μLRnaseinhibitor(20u/μL)1μL10MmdNTPMix2μLReverseTranscriptase(200u/μL)1μL④将体系轻柔混合短暂离心,在PCR仪进行以下程序：25℃，5min；42℃，60min；70℃，5min。6.4.内参基因和目的基因引物设计内参基因需是看家基因，目的基因要求PCR产物在350-800bp之间，且退火温度和内参基因引物的退火温度保持一致。6.5.内参基因和目的基因退火温度的确定进行不同的变性温度梯度PCR，内参基因和目的基因分管做，PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳6.6.PCR循环数的确定按普通PCR循环，设定为34个循环，内参基因和目的和目的基因分管作，内参和目的基因都做6管，在PCR的第18、20、22、24、36、28、30、32、34个循环各拿出1管，一起跑电泳。选择循环次数在线性范围内，且电泳效果好的次数作为最佳循环次数。电泳显示目的基因片段非常亮，而管家基因亮度一般则认为靶基因得到了超表达SUR1过表达实验设计方案