喜树替代紫茎泽兰过程中根际微生物群落特征

中国科学C辑生命科学2006,36(5):459~467459SCIENCEINCHINASer.CLifeSciences喜树替代紫茎泽兰过程中根际微生物群落特征*祖元刚①**高崇洋①王文杰①杨逢建①刘英①王敏①赵阳国②(①东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室,哈尔滨150040;②哈尔滨工业大学市政环境工程学院,哈尔滨150090)摘要为研究我国重要经济树种喜树根际分泌物对根际微生物群落的影响,以及喜树在控制林业有害植物紫茎泽兰生物入侵的可行性,采用传统培养技术和分子生物学技术PCR-单链构象多态性(SSCP)、末端限制性片段长度多态性(tRFLP)和16SrDNA文库相结合对喜树(Ca)、紫茎泽兰(Ea)和二者混栽体系(CE)根际土壤中的真核微生物和真细菌微生物群落结构进行了比较.计数结果表明,喜树、二者混栽以及紫茎泽兰根际中的真细菌数量依次减少,而真核微生物数量依次增多.PCR-SSCP分析显示,紫茎泽兰根际土壤中真核微生物条带数量(多样性)远高于喜树和混栽根际,对部分条带克隆测序表明喜树根际中Meristolohmanniaspp.为主要优势种群;tRFLP对真细菌结构分析表明,3种根际中真细菌群落多样性丰富,但没有差别,对喜树根际真细菌16SrDNA文库测序比较分析,共包含了10个已分类的门,其中Proteobacteria门为优势菌群,占24.71%(其中δ-Proteobacteria占17.65%),Acidobacteria门占16.47%,Bacteroidetes门占10.59%.另外,色谱分析发现喜树和混栽根际土壤中分别含有较低浓度喜树碱和羟基喜树碱,而紫茎泽兰根际二者均检测不到.由此可见,紫茎泽兰的扩散和蔓延依赖于特有的真核微生物群落结构模式,并不改变真细菌群落的结构,喜树能够通过根系分泌物改变紫茎泽兰根际真核微生物群落结构模式,进而制约其外延.本研究为喜树在紫茎泽兰生物替代中提供了理论基础.关键词喜树根际微生物紫茎泽兰单链构象多态性(SSCP)末端限制性片段长度多态性(tRFLP)16SrDNA文库收稿日期:2006-02-20;接受日期:2006-03-30*国家林业局林业有害植物调查专项、教育部重点项目(104191)、东北林业大学优秀青年教师创新项目和国家自然资金项目(批准号:30300271)资助**联系人,E-mail:[e-mail]喜树(CamptothecaacuminataDecaisne)是多年生亚热带落叶阔叶树,因其能够合成显著抗肿瘤活性的次生代谢产物喜树碱和羟基喜树碱而倍受人们的关注.喜树碱能够与人的拓扑异构酶I-DNA(TopI-DNA)共价复合物结合,抑制酶在超螺旋双链DNA上形成缺刻,从而阻止DNA的解旋,进而起到抑制肿460中国科学C辑生命科学第36卷SCIENCEINCHINASer.CLifeSciences瘤细胞复制的抗癌作用[1],文献还表明喜树碱能够专一抑制真核生物的TopI-DNA共价复合物而对原核生物没有作用[2].喜树碱类衍生物主要分离自喜树的嫩叶、种子及树皮中,有研究表明喜树根际也能够分泌喜树碱[3],由于喜树碱几乎对所有真核生物均具有抑制作用,所以喜树可能对根际土壤中的真核微生物群落结构产生很大的影响.紫茎泽兰(Eupatoriumadenophorum)作为重要的外来入侵植物越来越受到人们的重视,而对入侵植物的生物防治是昀具应用潜力的策略之一.研究表明,紫茎泽兰等许多外来植物的入侵是通过改变根际中微生物群落的功能来实现的[4~8],通过改变土壤中原有微生物群落模式来达到成功扩散的目的.而喜树根际能够分泌抑制真核微生物生长的物质,从而极有可能改变整个微生物群落的结构,进而破坏紫茎泽兰根际周围极具扩散性的微生物群落模式,从而实现对这种入侵植物的成功替代.根际中的微生物由于与宿主植物之间的相互依赖、相互制约的关系,致使不同植物根际的微生物群落具有很高的特异性[9,10],喜树作为重要经济树种,其根际微生物的群落结构也应存在其特异之处,而培养技术无法满足对其进行精确、客观、快速分析的要求.末端限制性片段长度多态性(terminalrestric-tionfragmentlengthpolymorphism,tRFLP)[11]和PCR-单链构象多态性(PCR-single-strandconformationpolymorphismPCR-SSCP)[12]技术作为重要的基因指纹技术,在揭示微生物群落结构与动态特征中应用越来越广泛.真细菌16SrDNA文库技术能更全面地揭示真细菌微生物多样性.Giovannoni等人[13]首先采用该技术分析马尾藻海海面上浮游微生物的多样性,发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群.目前,该技术已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、动物肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查,揭示了环境当中前所未知的微生物多样性.本研究采用传统培养技术对紫茎泽兰、紫茎泽兰-喜树、喜树3种根际中微生物数量进行了调查,并采用SSCP和tRFLP-16SrDNA文库技术对3种根际中的真核微生物和真细菌的多样性、相似性进行了比较,对喜树控制紫茎泽兰入侵和扩散的可行性进行了分析.1材料与方法1.1实验设计选择9个体积为0.6m×0.5m×0.22m栽培箱,装满菜园土后分别种植喜树、紫茎泽兰和喜树-紫茎泽兰各3箱,所有植株的株行距均为0.1m,植株与箱边距0.05m,每箱植株总量为6行×5株=30株,在喜树-紫茎泽兰混栽体系中,两种植物间行种植.在水、光、气等外界环境一致的条件下,温室栽培20个月.1.2生物量和根际土壤中喜树碱类衍生物测定(1)实验植物生物量的测定:分别测量喜树和紫茎泽兰的株高、基茎和植物干重,以Origin软件(OriginLabCorporation,MAUSA)中两样本独立性t检验分析喜树和紫茎泽兰各生物量在混栽及单独栽培时是否存在显著差别.(2)土壤中喜树碱类衍生物测定:分别于3种栽培体系不同重复栽培样的行间取5cm以下根际土壤20g,将相同体系土壤充分混匀后,取100g用于喜树碱和羟基喜树碱检测,其余根际土样直接用于平板菌落计数、挥发性悬浮固体/悬浮固体(VSS/SS)[14]检测和总DNA的提取.将100g根际土壤样本完全悬浮于100mL无水乙醇中,于室温下浸提60min后采用Whatman3M滤纸过滤,用50mL无水乙醇洗涤土壤,合并两次滤液.旋转蒸发滤液至3mL,取1mL转至1.5mLEppendorf管中,以10000×g离心8min,将上清移至一新管中待用.取600µL于高效液相色谱(日本Jasco公司)中按文献[15]中的条件和方法检测喜树碱和羟基喜树碱.1.3常规方法统计3种根际微生物数量将10g土壤溶解于200mL无菌水(加5g玻璃株)中,充分振荡,静置10min后,取上清液1mL,按10倍梯度依次稀释至10−10.取3样品的10−3~10−10稀释样,各0.2mL分别涂布于LB培养基(细菌)、查氏培养基(真菌)[16]平板上,每样重复3次.细菌置于37℃培养1天后计数,真菌置于28℃培养3天计数.取菌第5期祖元刚等:喜树替代紫茎泽兰过程中根际微生物群落特征461落(colony-formingunit,CFU)数在20~200个的梯度进行计数和比较分析.1.4分子生物学技术分析3种栽培体系根际中微生物群落的结构及组成(1)土壤总DNA的提取:取每种根际土样0.25g,以土壤DNA提取试剂盒PowerSoil(TM)DNAIsolationkit(MobioCAUSA)提取土样总DNA,昀终溶解于100µLddH2O中,采用紫外分光光度仪(DU800,BeckmanCoulterCAUSA)检测DNA浓度,并计算DNA产率(WDNA/W土样),各取3µL,以λ/HindⅢ(宝生物,大连)为marker进行电泳检测DNA纯度.(2)SSCP分析3种根际土壤中真核微生物多样性与相似性:为研究真核微生物多样性,采用真核类18SrDNA通用引物NS7(5′-ATAACAGGTCTGTGA-TGC-3′)和NS8(5′-GCAGGTTCACCTACGGA-3′)[17]以3种根际土壤总DNA为模板,扩增真核微生物18SrDNA的V8~V9区,约340bp.其中反向引物NS8的5′端采用磷酸标记,用于λ核酸外切酶识别及切除.引物合成及标记由Invitrogen(上海)完成.PCR扩增采用4管平行,反应体系25µL包括:10×buffer2.5µL(plusMg2+),引物各0.75µL(0.6µM),dNTP2µL(200µmol/L),ExTaqDNA聚合酶0.8U(宝生物,大连)),模板10~50ng.反应于GeneAmpPCRsystem2700PCR仪(Perkin-Elmer,Singapore)进行,程序为:95℃预变性5min,接以30个循环包括:95℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸1min,昀后72℃延伸10min.4管混合后以纯化试剂盒(NucleoSpin®ExtractII,Macherey-Nagel,Germany)纯化,并昀终溶解于40µLddH2O中.取3µLPCR产物与DL2000marker(宝生物,大连)于1%的琼脂糖凝胶电泳检测浓度.λ核酸外切酶能够专一降解双链DNA中5′磷酸标记的链,从而使非标记的单链释放出来[18],这样既减少了SSCP图谱中非特异性带,又提高了精确度.100µL反应体系中包括λ核酸外切酶(NEB,MAUSA)30U,纯化的PCR产物15µg,37℃温浴2h.为减少蛋白质和核苷酸等杂质对SSCP图谱质量的影响,采用酚/氯仿法纯化酶切产物,并昀终溶于20µLddH2O中.SSCP分析采用0.67×MDEMatrix(Cambrex,Rockland,MEUSA)于室温下进行.酶解产物5µg与5µL变性液混合,95℃变性10min上样,250V电泳(PowerPac1000,Bio-Rad,CAUSA)12h.电泳结束后,按Bassam等人[19]的方法进行银染.获得的SSCP图谱采用UMAXPowerlook1000(TXUSA)扫描.将3种根际真核微生物SSCP图谱数字化,在同一迁移率下,有条带计为1,无则为0,然后对图谱各泳道进行主成分分析(principalcomponentanalyses,PCA)[20].将各泳道中浓度较高的条带回收后,采用相同的引物进行PCR扩增及λ核酸外切酶处理,以验证与原来条带是否具有相同的迁移率,然后克隆进T载体(pMD19-T,宝生物,大连)进行测序.采用序列分析软件Sequencher5.0(GeneCodes,AnnArbor,MI)去掉两侧载体序列,并通过Blast[21]在GenBank中检索昀相似序列.(3)tRFLP和16SrDNA文库相结合分析3种根际真细菌多样性和相似性:在构建16SrDNA文库和tRFLP分析时采用相同的真细菌16SrDNA序列保守引物:Eub-8F5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和Eub-926R5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′[11],分别对应于E.coli16SrRNA[22]的8~27bp和926~907bp.在tRFLP分析时,引物Eub-8F的5′端采用6-FAM进行荧光标记,引物由Invitrogen(上海)合成并标记.PCR体系及程序同SSCP分析,每样品平行做4管,PCR产物混合后用于后续分析.喜树根际真细菌16SrDNA文库构建及测序:将喜树根际真细菌微生物的PCR产物混合后,采用切胶回收试剂盒(上海华舜)纯化回收,连接于pMD19-T载体(宝生物,大连)中,转化后采用菌落PCR法[23]快速检测转化子中是否已经插入目的片段,当插入频率80%时,随机选取100个克隆用于测序.测序采用M13通用引物在ABI3730上进行,正反向各测一个反应,以保