PRRSV基础知识

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒分子生物学研究进展摘要：猪繁殖与呼吸综合征是目前养猪业中一种严重的病毒性传染病，引起猪严重繁殖障碍和呼吸道疾病。该病的病原体属于动脉炎病毒属，是一种不分节段的单股正链RNA病毒，含有8个开放阅读框（ORFs），ORF1编码非结构蛋白，ORF2～ORF7编码结构蛋白。其中ORF7编码的核衣壳（N）蛋白和ORF6编码的非糖基化基质（M）蛋白为优势结构蛋白。猪繁殖与呼吸障碍综合征毒基因组存在广泛的遗传变异性，M蛋白和N蛋白在所有的毒株之间相对比较保守，可作为血清学诊断的靶抗原。文章就猪繁殖与呼吸障碍综合征毒在分子生物学方面的研究情况作一综述。关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒；基因组；遗传变异；分子生物学猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种传染病，以引起母猪繁殖障碍、仔猪和育成猪呼吸道症状及高死亡率为主要特征1。该病于1987年首次在北美发现2，之后在世界范围内迅速传播，给养猪业造成了极大的经济损失。郭保清等（1996）3首次在国内疑似PRRSV感染的猪群中分离出PRRSV，从而证明了该病毒在我国的存在。目前，PRRSV也已成为我国重要猪传染病病原之一。1分类、形态及理化特性PRRSV属于第10次国际病毒大会上新设立的动脉炎病毒科动脉炎病毒属4，其同属成员还有LDV、EAV和SHFV。PRRSV系不分节段的单股正链RNA病毒，电镜观察纯化的病毒粒子呈球形，直径约为45nm～83nm，内有一个呈20面立体对称的具有电子致密性的核衣壳，其直径为25nm～35nm，表面上有约5nm的突起，外绕一层脂质双层膜。PRRSV对氯仿、乙醚等脂溶剂和去垢剂敏感。在氯化铯和蔗糖密度梯度中浮密度分别为1.13g/cm3～1.19g/cm和1.18g/cm3～1.23g/cm3；RRSV热稳定性差，低温下有较好稳定性，-70℃下可长期保存，56℃经45min完全失去致病性，干燥条件下也可使病毒迅速失去感染性；PRRSV对pH敏感，在6.5pH7.5的环境中稳定，不耐酸碱，pH7或pH5可使病毒感染力迅速丧失。自然分离到的PRRSV不凝集猪、羊、鸭、鸡、小鼠、豚鼠及人的O型红细胞，但经非离子去垢剂和脂溶剂处理后，可凝集小鼠的红细胞。2病毒的基因组结构和表达PRRSV的核酸系不分节段、单股、正链RNA，大小约为15kb，含8个开放阅读框（ORFs），其3′端有一个Poly(A)序列，PRRSV基因组顺序为5′-ORF1a和ORF1b-ORF(2-6)ORF7-3′端。ORF1（包含重叠的16个核苷酸的ORF1a和ORF1b）长约12kb，占整个基因组的80%，位于基因组5′端211个碱基的非编码前导序列之后，编码病毒RNA复制酶和聚合酶，其氨基酸序列含有EAV和LDV的保守成分5；ORF1a编码区有一些疏水区，一个推定的丝氨酸蛋白酶区和富含半胱氨酸区；ORF1b含聚合酶元序列、蜗牛酶元序列、富含半胱氨酸和组氨酸的锌指区及功能不明的保守区4个特定区域6。在ORF1a和ORF1b的重叠区可识别出7核苷酸结构（UUUAAAC）和形成RNA拟节序列，这两种结构为RNA聚合酶翻译过程中核糖体移码所必需。ORF2～7分布在约3.5kb的3′端。ORF7的终止密码子之后为114个碱基的非编码区和仅20个碱基的Poly(A)尾序列，相邻的ORF框之间发生部分重叠。ORF2～5编码病毒4种囊膜相关蛋白GP2-5,ORF6编码非糖基化蛋白；ORF7编码核衣壳（N）蛋白。3′端非编码序列可能是复制过程中负链RNA开始合成时聚合酶结合的区域。PRRSV的基因表达模式与冠状病毒和凸隆病毒类似，其转录机制为先导引物机制，通过产生6个亚基因组mRNA进行基因表达。转录中先导序列连接到每个mRNA中，产生具有相同的5′端先导序列的亚基因组mRNA，其长度超过200个碱基，且3′端也有相同的共同序列（CCGG/AAATT）Poly(A)的嵌套式结构。另有研究报道认为病毒是通过产生7个亚基因组mRNA来表达的，其额外的亚基因组mRNA3.1来自于ORF3与ORF4之间。3病毒蛋白PRRSV基因组编码的蛋白有复制酶、聚合蛋白和结构蛋白。ORF1编码复制酶和聚合蛋白，是唯一的非结构蛋白，参与病毒的复制。ORF1a编码的聚合蛋白经裂解后产生6个非结构蛋白（NSP1α，NSP1β和NSP2-5），其中NSP2的氨基酸序列在北美洲株（VR2332）和欧洲株（LV）之间的同源性仅有32%，实验表明NSP2基因中含有B细胞表位免疫的优势基因；NSP1α和NSP1β包含两个类木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶区，已证实可从1a和1ab多聚蛋白上自动切割下来7。ORF1b编码的聚合蛋白长约1463个氨基酸，被ORF1a编码的蛋白酶切割后形成RdRp、CP2、CP3和CP44个蛋白。GP2为结构糖蛋白8，由ORF2编码，分子量为29ku～30ku，可被单克隆抗体WBE2识别，有两个明显的疏水峰和糖基化位点，LV的GP2能整合入病毒粒子中。肽链内含有二硫键，通过二硫键和其它结构蛋白可形成同源或异源多聚体，其糖基化位点覆盖有N-聚糖复合物。GP2蛋白表面有一个抗原位点，其周围有一个与GP5蛋白B细胞抗原位点构成二级结构的VSRRIYQ基元。GP2蛋白免疫原性很差，在病毒中含量较少，很难从感染的细胞裂解液或纯化的病毒粒子中得到分离鉴定9。GP3为高度糖基化蛋白，具有7个糖基化位点，分子量为40ku～50ku，含265个氨基酸。现在对GP3是否为结构蛋白尚无定论。GP3蛋白羧基端有一个与病毒血清型有关的非中和抗原表位，其可能引起病毒基因型抗原株的差异。GP3是PRRSV各毒株间保守性最差的蛋白之一，在欧、美型毒株间推导氨基酸的同源率为54%～60%，而且多数变异发生在N末端。Duran等人用杆状病毒表达载体表达了PRRSVORF3的产物，表达产物可给猪提供68.4%的保护率，说明ORF3表达产物在抵抗病毒感染时具有一定作用。GP4蛋白是病毒的主要结构蛋白之一，分子量约为31ku～35ku，有4个糖基化位点，其N端和C端有高度的疏水区。该蛋白氨基端有一信号肽序列，在GP4蛋白胞外区第40位～第79位氨基酸之间有一个可与单抗发生中和反应的抗原决定簇。GP5为糖基化的囊膜（E）蛋白，分子量约为26ku～30ku，相当于EAV的囊膜糖蛋白GL，含4个糖基化位点和一段31个氨基酸的信号肽，该蛋白含有一段很大的内部疏水区。E蛋白与M蛋白在囊膜内由二硫键结合成异源二聚复合物，其内含有与病毒有关的免疫重要区。GP5有6个抗原决定簇，能诱导机体产生特异性中和抗体10，其中一个血清型特异的线性决定簇能在体外中和病毒感染，且中和能力强于GP4诱导产生的抗体，但这种单抗产生的中和作用与抗GP5滴度具有明显的相关性。用PRRSV中和性单可隆抗体和猪高滴度中和血清抗体，从PRRSVcDNA噬菌体文库中筛选出了位于GP5蛋白上的两个B细胞抗原位点A和B，非中和抗原位点A可以被非中和抗体识别，不被单抗ISU25-C1和猪中和血清抗体识别，在分离株中高度可变，具有免疫优势，该位点的抗体出现在PRRSV感染的早期；抗原位点B可被单抗ISU25-C1和猪中和血清抗体识别，不被非中和抗体识别，在分离株中高度保守，在PRRSV感染中连续存在，没有免疫优势。推测位点A可能诱导机体产生抗GP5抗体，使抗位点B的抗体产生推迟了至少3周，故GP5蛋白B位点抗原对设计PRRSV疫苗十分有用。研究证实PRRSV的基质蛋白和囊膜糖蛋白GP5是淋巴细胞增生性应答的靶点。另有报道，GP5可诱导并引发细胞凋亡11。ORF6编码非糖基化蛋白，即基质蛋白，也称M蛋白，分子量为18ku～19ku。VR2332型和LV型分别含有174和173个氨基酸。M蛋白的N端有3个疏水性跨膜区，针对该蛋白的单抗从欧洲和北美洲的分离株中识别出2个共同和1个独特的抗原决定簇12。M蛋白在所有的PRRSV株间高度保守，在欧、美型毒株间也最为保守。通过感染猪康复血清的Western免疫印迹试验证明了M蛋白具有很强的免疫原性，感染后10d就可以检测该抗体应答。表达重组的M蛋白可作为血清学实验的靶抗原。ORF7编码核衣壳（N）蛋白，分子量为13.8ku～15ku，碱性，亲水性，具有一个糖基化位点，但非糖基化蛋白。北美洲型和欧洲型分离株分别含有123个和128个氨基酸。N蛋白有6个疏水区及至少5个抗原决定簇，其中既有对所有毒株保守的共同决定簇，又有北美洲各型和欧洲各型的特异性决定簇12。推测C末端对抗原决定簇的形成起重要作用。N蛋白在病毒粒子中含量较高，约占病毒蛋白总量的20%～40%，具有较高的免疫原性。通过Westernblot证明猪感染PRRSV后最早出现（大约7d）的是针对N蛋白的抗体，且该抗体可持续存在半年以上，因此N蛋白可作为PRRSV抗体的检测抗原，无论早期还是晚期都有重要的诊断学意义；但此抗体为非中和抗体，对机体无保护作用，无免疫学价值9。4病毒基因组的遗传变异PRRSV分离株间核苷酸序列存在广泛变异。利用多克隆抗血清和单克隆抗体对PRRSV株进行血清学试验证实了PRRSV株间有显著的抗原差异性。依据血清学及基因序列分析将PRRSV划分为两种基本基因型，以LV型为代表的欧洲型和以VR2332为代表的北美洲型13，两者的核苷酸序列同源性约为60%。已有的序列分析显示，PRRSV和LDV的亲源关系近于它和EAV的关系，欧洲型毒株间的变异明显小于美洲型毒株间的变异，且ORF3和ORF5是结构蛋白编码区中保守性最差的两个阅读框。欧、美毒株间M蛋白最为保守，氨基酸同一性可达78%～81%，GP5蛋白氨基酸序列差异最大，同源性仅为51%～55%。美洲型毒株的3′非编码区序列比欧洲型毒株的此序列长22个核苷酸，同源率为59%。根据北美毒株间高度变异的特征，有学者建议将北美洲型再分为几个亚型14。此外各毒株的Poly（A）位的数量也可能有差异，或许与病毒复制相关15。对ORF5的RT-PCR产物用Mlul进行RFLP分析，可区分疫苗株和其它北美洲分离株，但这种单纯的RFLP方法难以区分朝鲜分离株和美国来源于VR2332的弱毒疫苗株16，原因可能是PRRSV的毒力变异是一种多位点的累积效应。对魁北克参考株ORF3～7进行分子序列分析，发现魁北克株与Lelystad(LV)病毒之间出现了广泛变异，而其与美洲毒株关系较为密切。PRRSV在猪体内持续感染过程中，会有亚种或病毒亚群的出现17。近年来在许多使用PRRSV弱毒疫苗的猪场暴发了该病，对分离出的PRRSV及疫苗毒进行序列测定和分析，发现疫苗毒在选择性压力作用下会发生返强突变16。DeeSA等18在一个有PRRSV慢性感染的种猪场，在不同时期对仔猪血清内病毒（PRRSV）进行了基因检测和分离，发现该猪场存在A、B、C3个PRRSV基因型，不同基因型PRRSV的ORF5基因差异为5.8%～11%，同一基因亚型基因同源性达99%，说明PRRSV毒株间存在基因重组。Itou等通过对日本1991年-1999年流行PRRSV的研究分析，证实了在一定区域和时间内PRRSV可能发生基因变异或重组。研究证明，PRRSV的RNA重组优先发生在有高度相似性的亲代株之间，两株北美洲株或两株欧洲株之间发生重组的可能性比一株北美洲株和欧洲株之间的可能性大10000倍。杨汉春等19对PRRSVBJ-4全基因组进行序列测定与分析，表明基因组全长15504个核苷酸,与VR2332高度同源（同源率高达99.5%），与LV株相比却发生了广泛变异。刘光清等20对PRRSVCH-1a株的非结构基因进行了克隆和测序，分析表明CH-1a株ORF1全长11882nt,ORF1a和ORF1b与VR2332株和LV株的核苷酸同源性分别为89%，92%，54%