qPCR讲座

荧光定量PCR技术原理及应用LMSu,2015Vazyme,China主要内容qPCR的原理•化学原理•数学原理qPCR的实验流程及注意事项qPCR的应用--绝密--qPCR的原理什么是qPCR？Real-timePCR，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。qPCR化学原理荧光（染料、荧光基团)SYBRTaqManqPCR化学原理SYBR一种DNA小沟非饱和性结合染料与DNA结合时发光/不结合(游离)时不发光每形成一条DNA双链，就会有一定数量的染料结合上去染料一结合，就会产生荧光信号信号强度与DNA分子总数目成正比（unless）变性退火延伸qPCR化学原理TaqManProbe一种水解探针(5’Reporter,3’Quencher)完整时不发光/水解后发光每形成一条DNA链，就会水解一条探针每水解一条探针，就会产生一个单位信号信号强度与结合过探针的DNA分子总数目成正比（unless）SYBRVSTaqManProbeSYBRTaqMan优点价格便宜特异性高适用性广支持多重荧光定量操作方便缺点引物要求高价格贵特异性稍差只适合特定目标不能进行多重定量qPCR化学原理•数学原理：通过循环数“n”（Ct值）来计算N0起始DNA量VSCTqPCR数学原理N=N0x2nqPCR数学原理N=N0×(1+e)nN产物分子数N0起始分子数e扩增效率n循环数qPCR数学原理•定量数学原理，DNA量VSCT？qPCR数学原理•定量数学原理，DNA量VSCT？qPCR数学原理•定量数学原理，DNA量VSCT？qPCR数学原理qPCR的实验流程及注意事项1.组织保存：样品离开活体或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。RNA制备新鲜组织：立即加入裂解液，并迅速彻底匀浆；或液氮速冻，液氮/-70℃保存。（注：不可直接放到-70℃）RNAKeeperTissueStabilizer：无需液氮速冻，只要浸入RNAKeeperTissueStabilizer中，即可在37℃保存1天，室温保存1周，4℃保存4周或在-20℃/-80℃长期保存。(注：先4℃过夜，再冻到-20℃)冰冻组织：液氮研磨RNAKeeper-ICETissueTransitionBuffer：在-20℃使组织软化，并保护RNARNA制备2.RNA提取（不可贪多！）:RNAisolater/Trizol提取RNA制备3.RNA质量判断：2000bp1000bp100bp28s18s5s2%琼脂糖电泳，28S和18S条带清晰，且28S:18S1，完整性OK！完整性检测RNA制备4.纯度检测（A260/280,A260/230）：纯的RNA：A260/280、A260/230均在2.0左右A260/2301.8:异硫氰酸胍，酚残留，对逆转录反应影响很大！RNA制备qPCR的实验流程及注意事项引物的选择：RT-PCR应用推荐引物特定转录本Gene-specificprimers长片段转录本Oligo-dTorgene-specificprimers长转录本的内部片段Gene-specificprimer,randomoligomers,oramixtureofoligo-dTprimersandrandomprimers.基因组残留gDNARNARNA基因组污染情况检测：NRTRT-PCRqPCR的实验流程及注意事项qPCR分析内参基因的选择引物设计实验设计布板图谱分析及常用名词相对定量的数据分析绝对定量的数据分析内参基因的选择引物设计实验设计布板图谱分析及常用名词相对定量的数据分析绝对定量的数据分析qPCR分析始终选择表达充沛、均一的基因做为内参基因不要盲目选择常用的内参基因常用内参基因：GAPDH，Actin，Tublin内参基因的选择：qPCR分析qPCR分析内参基因的重要性案例：测定细胞样品1和细胞样品2中X基因的相对表达量Sample1Sample2Ct:25Ct:26基因表达量Sample1/Sample2=2△Ct:-1样本量差异-RNA差异-逆转录差异-cDNA差异Calibrator！！！(内参，Normalizer)qPCR应用-相对定量加入内参校正后Sample1Sample2Ct:25Ct:26内参Ct:20内参Ct:22△Ct:5△Ct:4△△Ct：1基因表达量Sample1/Sample2=1/2内参基因的选择引物设计实验设计布板图谱分析及常用名词相对定量的数据分析绝对定量的数据分析qPCR分析引物长度（17bp-25bp）产物长度100～200bp3’端应尽量避免高GC或高AT含量区域。3’端最后一个碱基最好为G或者C，避免使用T。正反向引物的Tm值最好相差不要超过1℃。GC含量（40%-60%）引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀避开T/C或者A/G的连续结构避开引物内部或者两条引物之间的互补序列NCBIBLAST引物设计：qPCR分析引物设计软件PrimerPremier5BeaconDesigner建议选取得分高的2-3对引物，进一步用实验验证内参基因的选择引物设计实验设计布板图谱分析及常用名词相对定量的数据分析绝对定量的数据分析qPCR分析倍比稀释预实验：qPCR分析溶解曲线标准曲线预实验：qPCR分析实验对照：空白对照（NTC）：用水替代cDNA模板（eachprimerpair/run）—排除体系自身污染—Ct值有效右缘RNA对照（NRT）：用NORTControl为模板（eachRNAsample）—排除基因组带来的污染qPCR分析内参基因的选择引物设计实验设计布板图谱分析及常用名词相对定量的数据分析绝对定量的数据分析qPCR分析布板：便于加样、条理清晰qPCR分析内参基因的选择引物设计实验设计布板图谱分析及常用名词相对定量的数据分析绝对定量的数据分析qPCR分析溶解曲线单峰—产物特异qPCR图谱分析及常用名词线性图谱对数图谱qPCR图谱分析及常用名词基线、阈值、CT值线性图谱对数图谱qPCR图谱分析及常用名词基线设置软件自动选择基线区域（默认基线期为3-15）qPCR图谱分析及常用名词案例：扩增曲线下降仪器默认基线重新设置基线qPCR图谱分析及常用名词基线、阈值、CT值：阈值（Threshold）—可以相信的最低荧光值阈值决定ct值qPCR图谱分析及常用名词基线、阈值、CT值：阈值（Threshold）—可以相信的最低荧光值阈值qPCR图谱分析及常用名词阈值设置qPCR图谱分析及常用名词手动调节阈值qPCR图谱分析及常用名词基线、阈值、CT值线性图谱对数图谱基线期与指数期接合部扩增曲线与阈值的交点qPCR图谱分析及常用名词Ct：18-28or15-33样品如何稀释？Ct值有效性判断•溶解曲线（MeltCurve）单峰•无模板对照（NRT）Ct值为A1，模板Ct值为A2A1-A25•Ct值有效右缘：无模板阴性对照（NTC）的Ct值-3荧光定量PCR数据有效性国际标准线性关系以及扩增效率确认：标准曲线相关系数（R2）0.98标准曲线斜率介于-3~-3.5之间PCR扩增效率（E）介于0.9~1.2之间重复性确认：重复管之间的STD0.2特异性确认：扩增产物溶解曲线无明显非特异性扩增产物/引物二聚体杂峰qPCR图谱分析及常用名词内参基因的选择引物设计实验设计布板图谱分析及常用名词相对定量的数据分析绝对定量的数据分析qPCR分析公式--2-ΔΔCt：①Ct处理–Ct内参(处理)=ΔCt处理；Ct对照–Ct内参(对照)=ΔCt对照②ΔCt处理–ΔCt对照=ΔΔCt③倍数差异=2-ΔΔCt处理对照相对定量的数据分析案例分析：样品待测基因Ct值内参Ct值对照处理28.425.917.918.22-△△CT法计算处理前后表达水平的倍数差异：ΔCt处理=25.9-18.2=7.7ΔCt对照=28.4-17.9=10.5ΔΔCt=ΔCt处理-ΔCt对照=7.7-10.5=-2.8倍数差异=2-△△CT=2-(-2.8)=6.9相对定量的数据分析处理后，基因上调表达，表达倍数为6.9倍内参基因的选择引物设计实验设计布板图谱分析及常用名词相对定量的数据分析绝对定量的数据分析qPCR分析绝对定量PCR：根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值xxx个拷贝标准品的类型：测什么用什么，仅限基因组使用质粒为标准品。（注：cDNA不能作为标准品）绝对定量的数据分析质粒标准品的制备：绝对定量的数据分析PCR目的基因克隆质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用目的基因目的基因目的基因质粒拷贝数的计算：平均分子量（MW）:dsDNA=(碱基数)x(660道尔顿/碱基)ssDNA=(碱基数)x(330道尔顿/碱基)ssRNA=(碱基数)x(340道尔顿/碱基)拷贝数计算公式:(6.02x1023拷贝数/摩尔)x(浓度g/ml)/(MWg/mol)=copies/ml.例：3000bp质粒，浓度100ng/ml，MW=3000bpx660dalton/bp=1.98x106daltons，1mol=1.98x106g.(6.02x1023拷贝数/摩尔)x(1x10-7克/微升)/(1.98x106克/摩尔)=3x1010copies/ml.绝对定量的数据分析倍比稀释绝对定量的数据分析绝对定量实验案例：方法：从组织中提取RNA并进行反转录，以SYBR法进行荧光定量检测标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照实验步骤：•提取RNA并反转录•设计特异引物•荧光定量扩增结果分析：获取样品中目的基因的精确拷贝数绝对定量的数据分析实验数据：Samplecopies/mlCt1Ct2MeanCtSTD标准品5×10328.1828.6428.410.16标准品5×10425.2525.1425.190.04标准品5×10522.1122.4622.280.12标准品5×10618.6318.9218.770.10未知样品?20.5620.4520.50.05空白对照NoneNone绝对定量的数据分析扩增效率（E）计算E=10-1/斜率－1＝1.03标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线y=-3.17x+37.52R2=0.9988152025305×1035×1045×1055×106CopiesCt绝对定量的数据分析未知样品拷贝数的计算将Ct值带入线性方程：20.5=-3.1726X+37.52x=5.36QuantityUnknown=105.36=229087copiesqPCR扩增程序PrepareandheatCycling试剂：影响qPCR数据的一个重要因素Ace®Taq:热启动Taq酶高特异性高灵敏度稳定的扩增能力试剂：影响qPCR数据的一个重要因素AceQ®qPCRMasterMixAceQ®qPCRMasterMix兼容所有的主流qPCR仪:Roche,lightCycler®ABI,7X00,StepOne®BioRADAgilent……AceQ®qPCRMasterMixVazymeSupplierAVazymeSupplierAAceQ®qPCRMasterMix很多案例表明，我们的试剂显著更优异！VazymeSupplierBVazymeSupplierBAceQ®qPCRMasterMixVazymeSupplierCVazymeSupplierCAceQ®qPCRMasterMixVazymeSupplierDVazymeSupplierDAceQ®qPCRMasterMix一站式解决方案：