Real-TimePCR仪选购指南

Real-TimePCR仪的选购荧光实时定量PCR技术(real-timequantitativePCR,orqPCR)是现代分子生物学技术中最重要、应用最广泛的核酸定量检测技术。成功的定量PCR实验，除了精准的实验设计和操作流程之外，选择一台结果精确、性能稳定的定量PCR设备也是实验成功必不可少的因素之一。近年来，伴随着定量PCR技术的发展，各种定量PCR设备也如雨后春笋一般涌现，市场上在售的各种定量PCR设备种类繁多，性能各异，各种参数指标让消费者眼花缭乱无所适从。如何挑选一台适合自己实验需求和预算需要的定量PCR仪也成了一个困扰科研工作者的实际问题。定量PCR检测的原理是在PCR反应体系中加入特异的荧光标记基团，监测荧光信号在整个PCR进程中的累积过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。所以荧光定量PCR整个硬件设备可以分为光学系统、热循环模块和软件分析系统三个主要部分，我们仅从定量PCR仪转硬件配置的角度为您介绍一下定量PCR仪选购中的一些注意事项。先说说热循环模块。热循环过程是整个PCR过程中的最重要也是最根本的因素，普通PCR仪在英文里就叫做“Thermocycler”，没有稳定的Thermocycle过程，模板DNA的精确检测定量也就是无本之木无源之水，根本无从谈起。所以各个定量PCR厂家无不在热循环模块上投入血本，做足文章。市面上常见的热循环模块一般是使用半导体温控的金属block，此外还有几种使用类似离心机转子式的空气温控组件，通过控制进入离心腔体里的空气温度来实现精确的温控。空气温控最大的好处就是极佳的管间温度均一性，但这种类型的定量PCR一般需要特殊耗材，而且空气温控方式的温度稳定性不容易控制，升降温过程中的温度过冲会比较剧烈，所以目前这种形式的定量PCR已不多见。热循环模块的主要衡量标准有两个，一是升降温速度，更重要的是温度均一性。升降温速度越快，当然PCR反应耗时越短，同时更快的升降温速度有助于降低引物的非特异结合，提高扩增反应特异性。需要注意的是仪器标称的升降温速度并非越快越好，很多厂家在参数指标中标称的只是block的升降温速度，实际上整个PCR反应体系需要一个热传递过程，如果升降温速度过快，会导致PCR反应体系与热循环模块之间的温度不同步，影响PCR反应的效率。在选购定量PCR设备时不宜盲目通过升降温速度衡量定量PCR仪的性能。如果我们确实对实验的速度要求比较高，那不妨选用专门的Fast反应模块。一些生产厂家会针对快速PCR反应推出专门的Fast反应模块，使用专用的耗材和试剂，通过缩小反应体系和使用更快速的聚合酶来实现快速PCR反应过程，与升降温速度相比，温度均一性是定量PCR仪更重要的参数指标，只有整个加热模块的温度均一才能保证所有反应复孔实验结果的高度一致。使用传统的heatblock最需要关注的边际效应问题。靠近模块边缘的孔由于与外界更加剧烈的热交换过程，往往扩增效果与靠近中心的反应孔有所差异，一般半导体温控原件的功率和性能越好边际效应影响程度就越低。很多厂商的定量PCR加热模块附带了温度梯度功能，温度梯度功能对于优化实验条件的时候摸索退火温度还是有一定帮助的。但老式的温度梯度模块使用模拟梯度，就是用户只设定模块上下两端的最高和最低温度，中间区域的温度梯度完全靠热传导过程自然形成，既没法控制也没法准确衡量，软件只给出一个计算出来的模拟温度，这种温度梯度实际上不太实用。比较新式的定量PCR仪一般会带有数字梯度功能，这种梯度的原理是把整个加热模块分割成几个不同的温控区域，分别使用不同的温控模块进行温度控制，进行温度梯度实验实验时模块上不同区域温度能够得到精确控制。如果我们经常使用新的引物，需要经常对实验条件进行优化，建议您最好选择具有这种数字梯度模块的定量PCR设备。除此之外，我们在考察仪器的温度性能时，最好不要完全盲目相信厂商提供的参数，各个厂商对于参数指标的检测条件和计算方法有所不同，参数好看的不一定性能就更稳定。确定仪器型号之前要多了解一下其他实验室对仪器的使用情况，另外最好选择一些市场占有率比较高的品牌和强势产品。光路系统我们都知道，荧光定量PCR使用的就是荧光检测技术，无论是标记在探针上的荧光基团还是结合在双联DNA上的荧光染料，都需要有激发光源进行激发，再由检测元件检测固定波长的发射光，所以定量PCR的光路系统包括也包括光源和检测元件两个部分（图例1.）图1.激发光源以固定波长激发荧光染料，检测原件检测和记录发射光的强度。常用的荧光激发方式有三种：激光、卤钨灯和LED；激光是纯粹的单色光，用来做荧光染料的激发光强度超级高而且基本上没有背景干扰，但激光光源的价格也和性能一样高高在上，市场上只有最高端的定量PCR设备才会使用激光光源，价格和性能都令我们绝大多数的普通用户高山仰止。相对于中低端设备使用的单色LED而言，卤钨灯或者氙灯的价格比较贵，需要定期维护和更换，但激发光的光谱范围比较宽，相对光强也较强。过去卤钨灯一般都会在中高端定量设备中配合冷CCD检测器使用，近年来随着白光LED技术的发展，卤钨灯寿命和性能上的确定逐渐影响了它的使用范围，目前已经逐渐淡出定量PCR的硬件舞台。单色LED光源光源成本低、寿命长，使用期间基本无需维护，目前在中低端定量PCR市场中几乎占据了统治地位；近几年发展起来的白光LED兼具卤钨灯光谱范围宽和LED性能稳定寿命上的优点，在中高端定量PCR仪中使用较多，但需要注意的是各个厂商所使用的白光LED性能各异，有些劣质LED的光谱范围不够平均，就会导致某些特定激发通道的光强明显低于其他通道。在定量PCR设备中主要使用滤光片进行单色滤光，光栅型单色系统在定量PCRT设备中比较少见。定量PCR设备使用的荧光检测元件常见的也有两种，光电倍增管（PMT）和冷CCD芯片，PMT多用于中低端设备，使用扫描检测模式，在灵敏度上PMT几乎可以达到CCD检测的同等水平，但由于光电倍增的工作原理，使用PMT检测一般背景噪音会相对较高，信号基线不够稳定，尤其在孔间和板间重复性上表现明显弱于CCD类型的检测设备。冷CCD价格比较高，一般用于中高端定量PCR设备，使用CCD检测的设备一般在孔间重复性上明显好于扫描设备，复孔之间的实验结果相对偏离会较小。目前市场上还有一些使用光电二极管（PDT）进行检测的定量设备，这种检测元件在成本上与PMT相当，检测结果的背景噪音低于PMT设备，但由于信号放大过程后置，所以检测灵敏度要低于使用PMT和冷CCD的设备，直接的表现就是相同样本检测的时候Ct值出得会比较大。关于光路系统另一个重要考虑因素就是检测通道数。定量PCR设备通过不同的激发和发射滤光片组合，可以同时检测多种不同的荧光染料，也就是我们所说的检测通道数。市场上常见的定中低端定量PCR设备一般会提供2-3个检测通道，高端设备一般都具有5-6个检测通道，我们在选择通道数量时应该根据自己的实际使用需要来进行选择。对于实验条件固化的检测实验室，可能多年都使用同样的检测方法和通道，这个时候有2-3个通道的设备不但能满足实验要求，也已经给可能出现的检测方法预留了空间。而对于实验条件和对象经常变化的研究型实验室来说，多通道不但意味着可以同时进行多重实验，也同时提供了极高的染料和方法适应能力。目前市场上常见的用于标记的荧光染料有几百种，同时还有大量的FRET探针通过不同染料的组合来进行靶标鉴定，所以中高端设备总的发展方向是更多通道和多种滤光片组合工作。目前市场上出现的高端仪器已经可以使用6组激发滤光片加6组发射滤光片，形成二十一种检测通道组合，这种检测能力对于丰富研究型实验室的检测手段还是具有重要作用的。事实上，硬件系统的性能仅仅是衡量定量PCR仪表现的一个方面而已，在实际选购过程中，我们需要考虑的还要包括定量PCR软件的功能，易用性、专门性等因素，对于研究型实验室，还要考虑定量PCR生产厂家的技术支持能力、应用支持能力和售后保障水平等诸多因素。