WesternBlotting操作指南

WesternBlot操作指导一：蛋白提取1、组织蛋白提取1）所需器材：制冰机、标记笔、两套1.5mlEP管（最好高温高压处理）、一个大冰盒、一个1.5mlEP管盒、手套、眼科剪（最好高温高压处理）、新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织、保存于4℃冰箱的PBS（最好高温高压处理）、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、两套研磨棒（最好高温高压处理）、掌上离心机、滤纸、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、离心机、烧杯、2×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、震荡器、泡沫板。2）操作步骤：a.制冰机制冰；b.标记笔将两套EP管做好标记；c.将大冰盒、EP管盒装上冰，一套标记笔做好标记的EP管放置于大冰盒中，另一套标记笔做好标记的EP管放置于EP管盒中，戴好手套，带上EP管盒、眼科剪剪取黄豆大小（约100mg）新鲜组织或保存于-80℃冰箱组织；d.取出保存于4℃冰箱的PBS，往EP管中滴加1mlPBS，眼科剪剪碎组织（动作快），掌上离心，弃上清，再往EP管中滴加1mlPBS，研磨棒研磨，3000转离心10分钟，弃上清，滤纸尽可能吸干管口残留液体，估算EP管中沉淀物体积，以上步骤尽可能在冰上操作；e.从4℃冰箱取出三去污裂解液，-20℃冰箱中取出PMSF置于大冰盒中，往EP管中滴加沉淀物3-5倍体积的三去污裂解液（一般为5倍）,再加入PMSF（二者比例为94：6）,研磨棒研磨（冰上充分裂解20-30分钟），以上步骤均需在进行；f.离心机预冷，将充分裂解后的组织液4℃、10000转离心10分钟；g.将烧杯用自来水洗净，倒入单蒸水，电炉上煮沸；h.备好2×SDS凝胶加样缓冲液（存放于常温），取出保存于-20℃冰箱的DTT,置于大冰盒中，将离心后的上清液用移液枪定量吸至另一套EP管中（勿吸取下层沉淀物），按上清液：2×SDS：DTT=1:0.8:0.2加入2×SDS及DTT，掌上离心，然后小心将EP管插入泡沫板，投入已煮沸的烧杯中煮6-8分钟（电炉功率不要调太大，以免管盖爆开）；i.将泡沫板用镊子取出，置大冰盒中冷却10分钟，掌上离心，再放入-20℃冰箱保存备用。注意：裂解液也可酌情选用单去污裂解液或细胞裂解液等。2、贴壁细胞蛋白提取（细胞蛋白含量一般约为1x10-9mg/细胞）1）所需器材：制冰机、细胞刮刀、标记笔、两套1.5mlEP管（最好高温高压处理）、两个大冰盒、手套、长满细胞的培养瓶、保存于4℃冰箱的PBS、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、滤纸、离心机、烧杯、4×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、泡沫板。2）操作步骤a.制冰机制冰；b.细胞刮刀用去离子水洗净、甩干，标记笔将2套EP管做好标记；c.将两个大冰盒装上冰，标记笔做好标记的两套EP管置于一个大冰盒上,带上另一个大冰盒，取出长满细胞的培养瓶平放在大冰盒上；d.戴好手套，取出保存于4℃冰箱的PBS、三去污裂解液、保存于-20℃冰箱的PMSF置于放有EP管的大冰盒上，往培养瓶中滴加2mlPBS漂洗一次，滤纸尽可能吸干瓶口残留液体；e.往培养瓶中滴加三去污裂解液（一般为47－141ul/50ml培养瓶）、再加入PMSF（二者比例为94：6），然后用细胞刮棒刮（不要漏刮四周瓶壁，刮不同处理组要更换刮子或重新洗净，滤纸擦干），倾角静置（使培养瓶内细胞裂解液集于一角），移液枪将培养瓶的裂解液吸至1.5mlEP管，冰上静置15-25分钟，以上步骤均需在冰上操作；f.离心机预冷，将静置15-25分钟后的EP管4℃、10000转离心10分钟；g.将烧杯用自来水洗净，倒入单蒸水，电炉上煮沸；h.备好4×SDS凝胶上样缓冲液（存放在常温），取出保存于-20℃冰箱的DTT置于冰上，用移液枪将离心后的上清液定量吸至另一套EP管中（勿吸取下层沉淀物），按上清液：4×SDS：DTT=3：0.8:0.2滴加4×SDS及DTT，掌上离心，然后小心将EP管插入泡沫板，投入已煮沸的烧杯中煮6-8分钟（电炉功率不要调太大，以免管盖爆开）；i.将泡沫板用镊子夹出，置大冰盒中冷却10分钟，掌上离心，再放入-20℃冰箱保存备用。注意：裂解液也可酌情选用单去污裂解液或细胞裂解液等。3、悬浮细胞蛋白提取1）所需器材：制冰机、标记笔、两套1.5mlEP管（最好高温高压处理）、两个大冰盒、长满细胞的培养瓶、10ml离心管、手套、移液枪、吸头（最好高温高压处理）、滤纸、保存于4℃冰箱的PBS（最好高温高压处理）、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一种蛋白酶抑制剂，剧毒）、离心机、烧杯、4×SDS凝胶上样缓冲液、二硫苏糖醇（DTT）、泡沫板。2）操作步骤a.制冰机制冰；b.标记笔将2套EP管做好标记；c.将两个大冰盒装上冰，标记笔做好标记的两套EP管置于一个大冰盒上,带上另一个大冰盒，取出长满细胞的培养瓶平放在大冰盒上；d.戴好手套，将培养瓶细胞悬液吸至10ml离心管，4℃、3000转离心10分钟，弃上清，加1ml保存于4℃冰箱的PBS重悬细胞，再转移细胞悬液至1.5mlEP管中，4℃、3000转离心10分钟，弃上清，滤纸尽可能吸干管口残留液体；e.取出保存于4℃冰箱的三去污裂解液、保存于-20℃冰箱的PMSF,往培养瓶中滴加三去污裂解液（一般为47－141ul/50ml培养瓶）、再加入PMSF（二者比例为94：6），移液枪吹打混匀，冰上静置15-25分钟，以上步骤均需在冰上操作；f.离心机预冷，将静置15-25分钟后的EP管4℃、10000转离心10分钟；g.将烧杯用自来水洗净，倒入单蒸水，电炉上煮沸；h.备好4×SDS凝胶上样缓冲液（存放在常温），取出保存于-20℃冰箱的DTT置于冰上，用移液枪将离心后的上清液定量吸至另一套EP管中（勿吸取下层沉淀物），按上清液：4×SDS：DTT=3：0.8:0.2滴加4×SDS及DTT，掌上离心，然后小心将EP管插入泡沫板，投入已煮沸的烧杯中煮6-8分钟（电炉功率不要调太大，以免管盖爆开）；i.将泡沫板用镊子夹出，置大冰盒中冷却10分钟，掌上离心，再放入-20℃冰箱保存备用。注意：裂解液也可酌情选用单去污裂解液或细胞裂解液等。二：电泳1、制备分离胶、积层胶1）所需器材：制冰机、制胶槽、Teflon梳子、小烧杯、手套、大冰盒、去离子水、30%聚丙烯酰胺溶液、1.5mol/L的Tris-cl（PH值8.8）、1.0mol/L的Tris-cl（PH值6.8）、10%SDS（十二烷基磺酸钠）、10%AP（过硫酸铵）、TEMED（四甲基乙二胺）、移液枪、吸头。2）操作步骤a.制冰机制冰；b.将制胶槽双层玻片装进制胶槽小夹子（双层玻片左右方及下方要注意对齐），滤纸吸干双层玻片中残留液体，再将小夹子装进制胶槽大夹子，平放（制胶槽所放平面一定要水平）；c.将大冰盒装上冰，戴好手套，取出保存于4℃冰箱的30%聚丙烯酰胺溶液、1.5mol/L的Tris-Hcl(PH值8.8)、1.0mol/L的Tris-cl(PH值6.8)、TEMED、保存于-20℃冰箱的10%AP，备好存放于常温的去离子水、10%SDS，根据所需配制的分离胶浓度及量，依次往小烧杯中加不同体积的去离子水、30%聚丙烯酰胺溶液、1.5mol/L的Tris-Hcl、10%SDS、10%AP、TEMED。加入TEMED后，立即用移液枪吸头混匀小烧杯胶液，倒入制胶槽双层玻璃中（留梳齿+1cm长以备加积层胶），轻轻抖动几下制胶槽使液面平齐，再用去离子水（当丙烯酰胺浓度〈8%时也可采用0.1%的SDS，当丙烯酰胺浓度〉10%时也可采用异丁醇）封闭液面以免氧气扩散进入凝胶抑制聚合反应，静置半小时；c.待分离胶凝固后（分离胶与去离子水界面可看到一条分离线），根据所需制备积层胶的浓度和量，往小烧杯中依次加入不同体积的去离子水、30%聚丙烯酰胺溶液、1.0mol/L的Tris-cl(PH值6.8)、10%SDS、10%AP，然后先将分离胶上层的去离子水倒去，再用去离子水冲洗去除未聚合的凝胶，滤纸吸净残留液体。往小烧杯加入TEMED，立即用移液枪吸头混匀小烧杯胶液，倒入制胶槽双层玻璃中分离胶上方，小心插入梳子，注意不能留有汽泡（操作时先使梳孔下缘接触液面，再左右两边平衡缓慢插入梳子），静置半小时待积层胶凝固（凝固后梳齿边缘可看到分离线）。2、电泳1）所需器材：电泳槽、手套、胶、电泳液（可回收利用，四次一换为好）、蛋白样品、1×SDS凝胶加样缓冲液、大冰盒、微量加样器、电泳仪。2）操作步骤a.将电泳槽上槽、下槽分别用去离子水洗净，甩干；b.戴好手套，取下制胶槽小夹子，缓慢移去梳子（两边要平衡移出），如有必要，使用接于注射器的平头皮下注射针头把积层胶上加样槽之间的齿弄直，再用去离子水冲洗以去除未聚合的丙烯酰胺，取下制胶槽双层玻片小心放入电泳槽上槽（较矮玻片向电泳槽上槽内侧），再一起放入电泳槽下槽，往电泳槽上槽缓慢倒入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（存放于常温，可回收利用，但最多4次），直至上槽电泳液略高于下槽电泳液，如有必要，使用接上注射器的弯形皮下注射针头把凝胶底部两玻璃板之间的汽泡排出，将电泳槽移至4℃电泳仪跑箱内；c.备好微量加样器、1×SDS凝胶加样缓冲液（存放于常温），取出保存于-20℃冰箱的蛋白样品，置于大冰盒上。将大冰盒移至电泳仪旁；d.将微量加样器在电泳槽下槽冲洗3次后，吸取不同蛋白样本，吸取体积一般为10-25ul，可根据蛋白浓度调整；加样时注射针头要缓慢上移，不要给侧壁太大张力；加不同样本时每加样完一个样本应在下槽中洗涤3次加样注射器（第一次洗涤液打掉）再加样另一样本，最后在所有不用的加样孔中点上等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液；e.插上电泳仪盖板（注意对好正负极），接通电源，100V恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂跑至底部（注意标记）（总用时依分子量大小和胶浓度而异，约2小时左右）。考马斯亮蓝染色：1、所需器材：两个培养皿（一大一小）、刮勺、考马斯亮蓝染色液（可回收利用）、脱色液（可回收利用）、胶、常温摇床或4℃摇床。2、操作步骤：1）将两个培养皿（一大一小）、刮勺用去离子水洗净，往小培养皿加入考马斯亮蓝染色液（约1/3体积）、大培养皿盖住；2）取出电泳槽内槽，取下制胶槽双层玻璃，去离子水冲洗，小心用刮勺刮开双层玻璃（刮勺放在中间，左右平缓向前用力），再用刮勺定量切去上端积层胶，下端上样缓冲液指示剂，左右两端多余泳道（比目的泳道多一泳道），小心用刮勺将胶放入盛有考马斯亮蓝染色液的小培养皿中，用大培养皿盖住常温摇床4小时以上或4℃摇床8小时以上；3）将考马斯亮蓝染色液回收，倒入脱色液，常温摇床脱色4小时以上或4℃过夜。三：转膜（半干转移法）1、所需器材：半干转膜仪、六个培养皿（三大三小）、手术剪、镊子、刮勺、小试管、滤纸、转移液、甲醇溶液、胶、直尺、手套、PVDF膜。2、操作步骤1）取出半干转膜仪阳极，平放操作台上；2）往两个小培养皿加入转移液（用大培养皿盖住）、另一个小培养皿加入甲醇溶液（用大培养皿盖住）；3）取出电泳槽内槽，取下制胶槽双层玻璃，去离子水冲洗，小心用刮勺刮开双层玻璃（刮勺放在中间，左右平缓向前用力），再用刮勺定量切去上端积层胶，下端上样缓冲液，左右两端多余泳道（比目的泳道多一泳道），右上角作一切口标记，记录胶的长度与宽度，去离子水冲洗后小心用刮勺将胶放入盛有转移液的一个小培养皿中（用大培养皿盖住）；4）戴上手套，定量剪一张长度和宽度均略大于胶的PVDF膜，用镊子将膜放入盛有甲醇溶液的小培养皿中，盖上大培养皿浸泡5分钟；5）取6张滤纸，放入盛有转移液的另一个培养皿中浸湿，拿至半干转移器阳极上，小试管轻轻擀压去汽泡，膜在盛有甲醇溶液的小培养皿浸泡5分钟后，用镊子小心将膜夹至滤纸上（注意膜的四边要在滤纸内），用刮勺小心将胶从培养皿中取出，放在膜上，精确对齐（注意胶的切口标记和胶的四边要在膜内），加点转移液润湿，再定量剪6张长度和宽度均略小于胶的滤纸，放入盛有转移液的培养皿中浸湿，拿至半干转移器胶上，加点转移液小试管轻