RNAi技术

基因工程中的RNAi技术学生：王勇学号：2014107046摘要：基因沉默技术已经被用来作为一种研究工具来研究某些细胞基因的功能。RNA干扰技术可引起细胞基因沉默。首先介绍RNAi的概念与起源和RNAi的作用机制与原理，随后介绍几种siRNA的获得方法及dsRNA的载体，最后对RNAi技术在研究功能基因应用方面进行展望。关键词：RNAi技术基因沉默前言：随着人类基因组计划的完成，越来越多生物的全基因组被测序，人们对功能基因组学的研究越来越深入。研究思路通常从两个方面展开，一是增强某种基因表达，研究过表达后引起的一系列机理；二是减弱或者终止其表达，进而推测该基因相应的生理功能。干扰基于后者针对性很强的特点，逐渐发展成一种新技术—基因沉默（Genesilencing）。从低等原核生物到高等真核生物，基因沉默技术的广泛应用推动了基因组学研究的革命化进程。文章对RNA干扰细胞引起基因沉默展开综述。RNAi的概念与起源1995年，康奈尔大学的Guo和Kemphues在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中发现了RNA干扰（RNAinterference，RNAi）现象。直到1998年，Fire和Mello等通过注射与秀丽隐杆线虫机体同源基因（靶基因）的双链RNA，阻断了靶基因的表达，并将其命名为RNAi，又称为转录后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing，PTGS）。RNAi潜在的作用促使Fire和TIllnnons继续实验，将能够表达出与C.elegsnnsunc-22基因同源的双链RNA的细菌喂食线虫，结果线虫表现出类似unc-22缺失的表型。随后人们又陆续在果蝇(Drosophila)、锥虫(Trypanosomes)、涡虫(Planarian)、斑马鱼(Zebrafish)、拟南芥(Arabidopsis)、大小鼠和人体内发现了RNAi现象，遗传学研究表明RNAi是真核生物中一种普遍存在且非常保守的机制,与真核细胞中许多重要生物学过程密切相关。斯坦福大学的AndrewZ.Fire教授和马萨诸塞州医学院的CraigC.Mello教授获得2006年诺贝尔生理学或医学奖,以表彰他们发现了RNAi现象。RNA干扰的作用机制与原理通过对RNAi现象的遗传学与生物化学研究,其作用机制已日渐清晰（图1）(Sharp,2001;Hnnano,2002;McManus&sharp,2002;Zamore,2002)，初步认为RNAi主要分为三个阶段。图1AModelforRNAi(science,vol296,page1264,2002)起始阶段dsRNA(double-strand-RNA，双链RNA)进入细胞，RNAi核酸酶与dsRNA结合，并将之降解成21~23bp的小片段dsRNA，这些小片段dsRNA被称为siRNA(smallinterferenceRNA)。siRNA与RNAi核酸酶结合成复合物。由于siRNA和RNaseⅢ切割产物的相似性，BendaBoss等认为在形成siRNA的过程中有RNaseⅢ的参与，Bernstein和他的同事发现果蝇中RNAi的发生与这种酶有关,他们把这种蛋白酶称为Dicer。除了含有两个RNaseⅢ共有区域外，Dicer还含有一个解旋酶区域、一个dsRNA结合区域和一个PAZ区域。Dicer酶具有高度保守性，在果蝇、烟草、线虫、哺乳动物和神经细胞中发现能够将相应种属的dsRNA加工成特定长度的siRNA。RNaseⅢ接触反应区域结构的阐明导致了Dicer切割产生22bp片段模型的建立。在该模型中，认为RNaseⅢ以二聚体酶形式起作用，反向平行的RNaseⅢ区域产生两个复杂的接触反应中心。效应阶段复合物中siRNA作为模板，其反义链与对应的同源mRNA结合，正义链解离出来，同时mRNA被降解并释放出RNAi核酸酶，然后重复这一过程，特异性降解下一个对应的mRNA。在果蝇中，RNAi通过一种称为RNA诱导沉默复合物(RNA一inducedsilencingcomplex，RISC)识别和降解目的mRNA。Zamore和他的同事们发现RISC在胚胎提取物中以大约250kDa大小的前体复合物的形式存在，在加入ATP(三磷酸腺苷)之后被激活形成约100KDa大小的能切割mRNA的复合物siRNA是双链结构，含有2个3，端突出碱基和一个5，端磷酸基团，该结构有利于siRNA与RISC复合物的结合。扩增和扩散阶段siRNA的反义链与目的mRNA结合后不仅诱导RISC对该基因进行降解，而且还激活RdRp(RNAdependentRNApolymerase，RNA依赖RNA聚合酶)介导的单链RNA的合成，产生大量的dsRNA，这些dsRNA又被切割成许多siRNA，进入下一个RNAI循环。因此只要注射很少量的dsRNA，就能扩增出许多dsRNA，从而在整个生物体细胞内发生基因沉默。在植物中也发现了类似的沉默现象，同时也发现RNAi不但能渗透到整株植物中，还能传递到通过嫁接移植的后代植株中。出现这种现象首先要求有一个细胞间传递信号的系统，其次要有一个增强信号的机制。研究提出一种称为转移RNAi的现象，转移RNAi指的是伴随一个特定基因沉默信号的迁移。例如在线虫中,瞄准3，端转录的RNAi导致相应mRNA的沉默和与目的序列具有同源性的siRNA的产生，而且与目的基因上游序列互补的siRNA也有产生和积累当这些siRNA与其它dsRNA互补时，其它dsRNA也被抑制，于是实现了转移。不管是在植物还是线虫中，dsRNA诱导的基因沉默都需要RdRP的参与,它能够增强RNAi信号。编码区RNAi技术和启动子区RNAi技术根据所选用siRNA序列的不同，可将RNAi技术分为编码区RNAi技术和启动子区RNAi技术：编码区RNAi技术。自1998年在线虫中发现RNAi现象以来，以基因编码区为靶序列的编码区RNAi技术已用于线虫功能基因组的研究。最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性腺或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达产生突变表型，但这种表型变化却不能遗传。这种早期的RNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的功能，但由于细胞分裂造成dsRNA的稀释，使得这种方法在研究成体的基因功能时有一定的局限性。为弥补早期RNAi技术的不足，Tavernarakis等对RNAi技术进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热激启动子控制在转基因生物中表达。热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形成具发夹环结构的dsRNA，从而产生RNAi，使目的基因沉默，这种改进的RNAi技术与传统的RNAi技术相比，具有明显的优点：首先转基因可以遗传给后代,有利于突变的分析；其次dsRNA可以被诱导产生，RNAi能够在发育特定阶段出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能成为可能；另外，当用细胞特异性启动子控制dsRNA的表达时，可以研究特定基因在不同器官中的功能。启动子区RNAi技术。M.F.Mett等证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21~23个核苷酸长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。由于多基因家族的各成员之间高度同源，因而使用编码区RNAi技术很难将各个成员区分开来研究，而多基因家族内的启动子序列通常比编码区变化大，采用启动子区RNAI技术有望将多基因家族的各个成员区分开来研究。这样综合编码区RNAi技术和启动子区RNAi技术的信息即可更全面地了解多基因家族各成员的功能。siRNA的获得目前可通过多种方法获得siRNA：化学合成、体外转录、RNA酶类物质（RNaseⅢ和Dicer）降解dsRNA、siRNA表达载体或者病毒载体、siRNA表达框架。前3种是通过体外制备然后再导入到靶细胞中，后2种是基于具有合适启动子的载体或转录元件在哺乳动物或细胞中转录生成siRNA。siRNA的传递载体由于siRNA相对分子质量较大和带有较高的负电荷，不能自发穿过细胞膜进入细胞内。脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。为适应大规模功能基因筛选，siRNA表达的病毒载体相继出现。主要以腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体。其中逆转逆转录载体MoMuLV(Moloneymurineleukemiavirus)和MSCV(murinestemcellvirus)两种类型。很多的分子生物学家认为RNAi是研究功能基因组的一个非常有用的工具。因为RNAi己被用来研究并搞清楚了包括果蝇、线虫和一些植物的基因的功能。通过向线虫体内注射dsRNA，给线虫饲喂能表达dsRNA的细菌，甚至是把线虫浸泡在含有dsRNA溶液中来研究RNAi，都可以高效而方便地找出突变表型。研究者甚至找到了更便利的方法，即通过增强内源的RNA发夹状结构的表达，诱导稳定的具有序列特异性的的沉默现象从而可以建立持续缺失某种功能表型的细胞系，为生化分析提供大量的沉默细胞，同时对某种表型进行长时间的观察评价也成为可能。很多类型的培养细胞都能生长在“RNAi芯片”一siRNA的点阵上面，可以记录基因组中每个基因被抑制表达以后的表型，以及多个基因被渐次抑制后的综合表型，从而可以知晓基因的功能及他们之间的相互作用。展望RNAi作为一种新的、强有力的研究工具，在功能基因组学领域呈现出巨大的应用前景，使得RNAi成为当今研究领域最引人注意的话题之一。相对于基因敲除技术（knockout），RNAi具有快速、有效、容易操作和序列特异性强等优点，被称为基因抑制（knockdown）技术，是研究特定基因功能的有效方法，因此，在某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基因敲除技术。总之，RNAi是一种有效、快捷和成本相对低廉的基因功能研究手段，与基因芯片等高通量基因筛选技术相结合，在哺乳动物细胞基因组学功能研究中将起重要作用，其应用前景不亚于PCR技术。