RNA干扰和siRNA转染的实用ppt

专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](China)英格恩生物Tel:[phone]内容第一部分RNAi实验基本概念第二部分RNAi实验具体设计第三部分siRNA转染过程相关问题及解答专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](China)英格恩生物Tel:[phone]主要内容1.RNAi的概念2.RNAi的启动途径3.非哺乳动物系统的RNAi实验4.哺乳动物系统的RNAi实验5.RNAi效应表现专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone]的概念RNA干扰(RNAinterference)是双链RNA（dsRNA)特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导的转录水平基因表达抑制。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone]的启动途径(1)dsRNA途径(2)siRNA途径(3)shRNA表达载体途径专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](1)dsRNA途径dsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长双链RNA(dsRNA)进入细胞后，经过胞质内双链特异性核酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA，进一步导致RNAi的发生。但在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的dsRNA会引起细胞潜在的抗病毒机制（干扰素效应）。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](2)siRNA途径小干扰RNA，长21-23bp，双链。作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的静默复合物(RISC)，siRNA的反义链引导RISC与mRNA分子互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑制。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](3)shRNA表达载体途径shRNA表达载体在细胞内表达shRNA后，在Dicer作用下形成siRNA分子，导致RNAi的发生。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone]实验如线虫、果蝇等可通过与靶基因序列互补的长链dsRNA（通常200bp）介导RNAi的发生。长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone]实验通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转染获得超过1周的基因表达抑制时间。通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的基因表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择shRNA表达载体较为合适。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone]效应表现RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](China)英格恩生物Tel:[phone]主要内容1.需要短期抑制还是长效抑制?2.采用siRNA进行实验的途径3.构建shRNA表达载体进行实验4.siRNA设计需要注意的问题5.脱靶效应6.转染是RNAi实验的瓶颈专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone]需要短期抑制还是长效抑制?1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2周。2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效应持续时间长。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone]进行实验的途径(1)化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最方便(2)体外转录(3)Dicer/RNaseⅢ酶解这三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone]表达载体进行实验需要构建相关质粒可利用载体上的抗生素等标记筛选，做长效表达不能做荧光标记，无法直观知道转染效率专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone]设计需要注意的问题(1)siRNA序列设计(2)阴性对照的作用(3)阳性对照的重要性(4)siRNA荧光标记的问题专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](1)siRNA的设计理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过在线设计软件进行，一些技术力量较强的化学合成公司可提供免费设计。如果有可能，多设计几条siRNA序列，以筛选最特异、最有效的siRNA序列。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](2)阴性对照siRNA的作用阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任何基因表达的改变，从而反映出小分子RNA片段进入细胞后对基因表达的非特异影响。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](3)阳性对照siRNA的重要性阳性对照siRNA采用确认有效的siRNA，针对某些较容易检测基因，如甘油醛－3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因；用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件、检测方法是否可行等；阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染体系进行RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺乏阳性对照siRNA，实验出问题无法找原因，耽误时间。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](4)siRNA荧光标记的问题采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率和优化转染条件，这种方法操作快速，实验费用也不高，但由于荧光标记的siRNA摄入与siRNA导致的抑制效果时常会出现不相关性，这种情况在某些细胞系和应用某些转染试剂时，如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染试剂优化转染条件时，不推荐使用荧光标记的siRNA。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](脱靶效应)(1)什么是RNAiOff-target(脱靶效应)?(2)脱靶效应如何检测？(3)siRNA浓度是否和脱靶效应相关？(4)转染试剂是否也会造成脱靶效应？(5)如何避免脱靶效应？专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](1)RNAiOff-target(脱靶效应)是什么？RNAiOff-target(脱靶效应)：简单地说，就是siRNA转染中的非特异反应，这不仅包括siRNA序列，还包括转染试剂本身或其他相关因素对转染细胞的其他相关基因发生非特异性的表达变化，从而导致假阳性和假阴性。目前已广泛引起研究者重视。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](2)脱靶效应如何检测？多种方法可以用于预测和检测脱靶效应，最常见的方法是基因表达谱芯片的方法。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](3)siRNA浓度是否和脱靶效应相关？以前认为高浓度会产生脱靶效应，实际上低浓度同样会产生脱靶效应。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](4)转染试剂是否也会造成脱靶效应？有人采用基因芯片检测对转染试剂造成的细胞基因表达影响发现，某脂质体L2K可以引发1908个基因的表达变化，既包括下调，也包括上调。如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达上调，可能出现转染siRNA后该基因可能会出现表达不变甚至增强的现象，从而出现假阴性现象，如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达下调，则会出现假阳性现象。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone](5)如何避免脱靶效应？脱靶效应并不能绝对避免，但可以采取措施减少脱靶效应的发生，如针对同一靶基因设计2条以上抑制效率在70％以上的不同siRNA序列，分别进行实验，可避免siRNA造成的脱靶效应；采用不同转染试剂进行实验可避免转染试剂造成的脱靶效应等。专业转染试剂制造商EngreenBiosystemCo,Ltd.(China)英格恩生物Tel:[phone]实验的瓶颈，转染质量的好坏直接关系RNAi实验的成败。(1)选择转染方法