RNA引导性基因编辑

RNA引导性基因编辑Apr02,2013NoCommentsRNA引导性基因编辑。本示意图描绘了Cas9（绿色）对CCR5基因上一个靶位点的切割过程。该过程由嵌合型向导RNA（chimericguideRNA.）介导。图片取自《自然-生物技术》（NatureBiotechnology）。在细菌、斑马鱼与哺乳动物细胞内，可编程RNA（programmableRNA）能够引导靶向性基因修饰（targetedgenemodification）。长久以来，低等生物（即原核生物与病毒）一直都是深受生物学家们欢迎的生物工具。毕竟，如果没有了限制性内切酶（restrictionendonucleases）或DNA聚合酶（DNApolymerases），分子生物学领域（或者说，整个基因组学领域）又将何去何从呢？目前有大量文章报道了RNA引导性基因组工程（RNA-guidedgenomeengineering）研究，这些研究指出细菌在没有这些酶的情况下，仍能够继续存活下去。成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats,CRISPR）系统是细菌与古细菌免疫系统的一个组成部分。CRISPR相关内切酶（CRISPR-associated，Cas）能够切断外源性的核酸，并能够由两种小分子RNA将其定向到其靶基因序列上。研究者们在去年发表的一项研究工作中指出，化脓性链球菌（Streptococcuspyogenes）的CRISPR-Cas系统（CRISPR-Cassystem）在体外能够用于指导对特定靶基因序列的切割。于是他们提出了这样一种可能，即这种方法可用于体内环境下的靶向性基因编辑（targetedgeneediting）。近期，研究者们以惊人的速度连续发表了五篇文章，证实了这种可能性的存在。哈佛大学医学院（HarvardMedicalSchool）的GeorgeChurch研究团队、博德研究所（BroadInstitute）的FengZhang研究团队，以及韩国首尔国立大学（SeoulNationalUniversity）的Jin-SooKim研究团队详细描述了用不同的方法来研究本质上相同的主题——即化脓性链球菌的Cas9核酸酶连同两种非编码性RNA，即CRISPRRNA（crRNA）与反式激活crRNA（trans-activatingcrRNA,tracrRNA一起，能够影响哺乳动物细胞内源性基因序列的切割过程。这两种RNA可以以嵌合的形式同时进入细胞内，或者分别单独进入细胞；它们在被导入细胞之前，可能会在质粒内或在体外环境下进行转录。最重要的是，不管用什么研究方法，研究者们都需要通过将靶基因序列与20个碱基对组成的crRNA进行互补配对，从而特异性地标记出该靶基因序列。以NGG形式存在的、所谓的前间区序列邻近基序（protospaceradjacentmotif,PAM）紧随在20个碱基对长的靶序列后，其必要条件是靶基因序列的长度必须达到最小限度。锌指核酸酶（zinc-fingernucleases）与转录激活因子样效应物核酸酶（transcriptionactivator–likeeffectornucleases,TALEN）为现在常用的生物工具；然而与这两种生物工具相比，如果用CRISPR-Cas系统来靶向于一段新的序列，就只需要设计出一种新的RNA向导（RNAguide）就可以了，而不需要设计两种新的酶。这些研究所报道的、CRISPR-Cas系统对哺乳动物基因的切割效率与TALEN的切割效率相当，甚至更胜一筹。Church的研究团队与Zhang的研究团队报道了切割位点上由于非同源末端连接修复（nonhomologousendjoining–basedrepair）机制所引起的遗传突变，他们也报道了通过同源重组（homologousrecombination），将供体的基因序列转导入细胞中。Kim的研究团队采用有限稀释法（limitingdilution），而并未使用抗生素选择法（antibioticselection），从而获得了突变型克隆细胞系，这说明细胞对该系统的耐受性非常好。同样来自于哈佛大学医学院的KeithJoung等人组成的研究团队应用RNA引导性基因编辑（RNA-guidedediting）技术，使斑马鱼的内源性基因产生突变，从而使80%以上的靶位点出现突变。尽管他们报道称该方法不会对胚胎产生显著的毒性效应，但是成鱼是否会出现不利表型，遗传变异是否能传递给下一代，这仍有待观察。通过基因编辑能够获得克隆细胞系，而且还不会使斑马鱼胚胎出现意想不到的毒性反应；这些事实都说明一个问题，即RNA引导性核酸酶（RNA-guidednuclease,RGEN）不会对真核细胞的基因序列进行不加选择的切割。但是它们的特异性如何呢？RGEN有多大的可能性会在靶外位点上进行切割呢？美国洛克菲勒大学（RockefellerUniversity）的LucianoMarraffini等人进行了第五项研究，给出了一些发人深省的观察结果。Marraffini等人利用CRISPR系统，对重组型肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）的基因组进行了RNA引导性基因编辑，同时他们还联合使用CRISPR系统与基因重组工程技术（recombineering），对大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）的基因组也进行了RNA引导性基因编辑。作为该研究工作的一部分内容，研究者们也对靶标切割的序列要求进行了研究。他们发现在靶序列上，如果PAM附近的12个核苷酸内出现单个核苷酸的改变的话，就会停止切割作用，但是每种单核苷酸改变对切割作用的影响程度并不一样。PAM序列是切割过程中至关重要的要素，但是机体还能够耐受PAM上的某些单核苷酸变异，即便这些单核苷酸变异会降低切割效率。尽管这些研究是在细菌内进行的，而且其他研究团队在真核生物体内和体外环境中的研究结果表明RGEN具有特异性，但是如果我们再继续进行更多的研究的话，我们将从该领域中获得利益。有一个观点是非常清楚的，即原核细胞生物学仍然是一块“富饶的狩猎地”，研究者们可继续在该领域内“挖掘“新的试验方法。原文检索：NataliedeSouza(2013)RNA-guidedgeneediting.NatureMethods,10(3):189.邓棋霏/编译