RT-PCR实验原理与步骤

RT-PCR实验原理与步骤2010-03-1912:34:47来源：易生物实验浏览次数：762网友评论0条RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应（ReverseTranscription，RT）产生cDNA第一链，再以cDNA为模板进行PCR扩增以检测目的基因的表达情况。关键词：RT-PCR逆转录反应ReverseTranscriptionRTcDNA【实验原理】RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应（ReverseTranscription，RT）产生cDNA第一链，再以cDNA为模板进行PCR扩增以检测目的基因的表达情况。【实验仪器】1.恒温金属浴2.PCR扩增仪【试剂及配制】RNAPCRKit(AMV)Ver3.0试剂包括：1.AMV反转录酶XL(5U/ul)2.10×反转录反应缓冲液3.RNAase抑制剂(40U/ul)4.随机引物9mers(50pmol/ul)5.RNAaseFreedH2O6.TaKaRaExTaqTMHS(5U/ul)7.5×PCR反应缓冲液8.dNTPMixture(各10mM)【实验步骤】1.反转录反应1）按下列组成配制反转录反应液MgCl22ul2.PCR反应1）按下列组成配制PCR反应液2）把此反应液加入到第一阶段反转录结束后的PCR反应管中，轻轻混匀；3）按以下条件进行PCR反应：94℃2min，94℃30sec、55℃30sec、72℃4min、30cycles，72℃5min。4）琼脂糖凝胶电泳检测结果。【注意事项】1.PCR条件设定退火温度可根据实际情况适当地提高或降低（50℃～60℃）。延伸时间因目的序列长度不同而不同。cDNA量较少时，循环次数可增加为40～50次。2.当同时需要进行数次反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然后再分装到每个反应管中。3.使用酶类时，应轻轻混匀，避免起泡；分取前要小心地离心搜集到反应管底部；由于酶保存液中含有50%的甘油，粘度高，分取时应慢慢吸取。4.酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回－20℃中保存。5.分装试剂时务必使用新的Tip头，防止样品间污染。6.最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同而不同，所以在使用您的样品之前最好先试做一下Control反应，以确定最佳的PCR条件。