Sau-PCR一种新型分子分型技术

就目前来看，RAPD和AFLP是应用最为广泛的两种分型技术，这两种技术各有优缺点。RAPD非常简单和快捷，而且对模板DNA没有很高的要求。但是RAPD技术十分敏感，即使是反应条件的轻微改变都会引起试验结果的变化。特别是对于某些模糊条带，更不能保证很好的重复性，AFLP虽然具有很好的重复性和稳定性，但是试验步骤相对繁琐。Sau-PCR技术首先用限制性内切酶切割基因组DNA片段，然后进行扩增。该技术吸取了RAPD技术和AFLP技术的精华，保留了前者随机扩增的概念和后者对基因组进行酶切分析的概念。与AFLP技术一样，该技术也是利用与限制性酶切位点相匹配的引物进行扩增，但是省去了添加接头的步骤。而且最近的产物可以在琼脂糖凝胶上进行电泳。该技术的名字来源于切割基因组DNA的限制性内切酶Sau3AI，它的酶切识别位点为GATC，这一片段G+C的百分比为50，所以在微生物基因组中还有大量的这种片段。其酶切后产生含4bp突出碱基的粘末端。这一特性，使完整的GATC序列保留在酶切后的DNA双链上，是进行引物设计所必须的，该引物的核心序列由这四个位于DNA双链末端的碱基组成。此外所有的Sau-PCR引物在它的5’端都添加了一个7个碱基的序列CCGCCGC，其与起始的低温退火过程无关，而是通过其含有的G、C碱基提供一个较高的解链温度为后续的高温退火过程服务。该序列的选择要考虑到避免自身二聚体的形成。补平双链：25℃5s，然后以0.1℃/s的速度逐步将温度升高到60℃，在60℃维持30s。低退火温度扩增阶段：94℃60s，50℃15s，然后以0.1℃/s的速度逐步将温度降低到25℃，然后再以同样的速度升温到50℃，并维持30s。该过程仅有GATC序列结合到模板上，GC序列并未参与。高退火温度扩增阶段：94℃15s，50℃60s，65℃延伸120s，整个过程重复35次，最后在65℃延伸5min。