SNP检测方法汇总

TaqManSNP基因分型技术方法：此技术是由美国Lifetechnologies公司研发的SNP分型技术，其技术原理如下简介。PCR反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团(quencher)。PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench)，从而发出荧光。两个探针的5’端标有不同的荧光(FAM或VIC)，3’端标有MGB淬灭基团结合体。根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP等位基因型。整个技术的示意图如下：应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。尤其适合针对全基因组SNP关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。RFLP(多重荧光)SNP分型技术已知的很多SNP位点正好位于限制性内切酶的识别区域，针对这些SNP位点我们就可以使用此方法进行SNP分型。尤其是对于大样品量的多个SNP分型来说，此方法的优势较为明显。技术方法：RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。它是第一代DNA分子标记技术。Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，通过电泳将其区分。现在我们用荧光标记其PCR引物，通过测序毛细管电泳来精确区分酶切片段大小，精度可以达到1bp的差异。通过对同一个位点的PCR产物不同SIZE的引物设计，实现了多样本的多重酶切，大大降低了检测成本。我们可以利用限制性内切酶的特殊属性来对一些SNP进行分型。有些SNP多态位点正好处于限制性内切酶的识别位点处，其中一种多态对应的PCR扩增片断能够被相应的内切酶切动，而另一种却不能，因此通过对酶切后的PCR产物电泳后的片断长度分析可知检测样本在该位点处的基因型。如果检测SNP位点不存在合适的酶切位点，往往可以通过在PCR引物3’端改变个别碱基引入限制性内切酶酶切位点，通过这种引物修饰法可以实现绝大多数SNP位点的分型都能用RFLP分析来实现。整个技术的示意图(以KpnI酶切位点SNP为例)如下：现在我们通过荧光标记PCR引物中的一条引物，另一条引物设计在序列的不同位置实现了，多位点扩增，多样本一起酶切，酶切PCR产物通过跑测序毛细管电泳将其精确区分，大大降低其检测成本。应用领域：本方法涉及到很多需要对突变或者SNP多态进行分型的遗传研究领域。高温连接酶检测反应技术多个SNP位点（3-8个）的分型项目，样本量可以几百个到上千个技术方法：连接酶检测反应(ligasedetectionreaction，LDR)是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别。高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行。如下左图：右边的探针与模板有一个碱基不配对，所以连接反应不能进行，没有连接产物；左边的探针与模板DNA完全互补，故进行连接反应。通过温控循环该特异性连接反应可反复进行，达到线性扩增的效果。当检测到DNA与互补的两条寡聚核昔酸接头对应处存在着碱基错配，则连接反应就不能进行。在同时存在着荧光标记的探针时，由于前者与模板DNA互补，故它与下游探针的连接反应得以进行，而后者则无法与下游探针连接。在连接反应结束后进行测序仪检测，检测到的结果即为G，从而可认定该SNP位点为G。LDR检测方法利用长度差异可以将多重LDR产物在ABI测序系统中进行检测，实现一次检测多个SNP位点。应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。MultiplexSNaPshot针对性的解决多个SNP位点（8-16个）的基因分型项目，样本量灵活，从几百到上千个样品。我公司利用由美国LifeTechnologies公司开发的SNaPshot技术，针对中等通量的SNP分型项目进行了技术上的改进大大提高了分型的通量和准确性。SNaPshot又称为小测序技术，是在一个含有测序酶，四种荧光标记的ddNTP,紧挨多态位点5’端的不同长度延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经ABI测序仪跑胶后，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。通过针对不同的SNP位点设计不同长度的延伸引物来做到多个SNP在一个反应体系中进行分型，目前我们已经可以做到15个位点同时分型通量。由于此方法为四色荧光标记，所以可以针对各种SNP类型进行分型，同时还可以对插入、缺失进行分析。技术体系的示意图如下：应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。尤其适合针对全基因组SNP关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。改进的多重高温连接酶检测反应技术该技术适合大样本（数百个以上）多位点（15-30个）的分型，能够提高SNP分型的通量，大大降低分型成本。iMLDR®技术是基于传统的连接酶反应经过改进后的具有天昊自主知识产权的多重SNP分型技术，相比于传统的连接酶反应技术，iMLDR提高了准确性和分型的成功率，经过重复实验和双盲样本的初步验证，该技术的数据准确性超过98%，仅次于测序和SNaPshot。分型原理：应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。尤其适合针对全基因组SNP关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。SNPscan高通量SNP分型技术适合于针对中等通量到大通量SNP位点的分型项目，至少800个以上样本、48个以上的SNP位点；对绝大多数SNP位点都具有很好的分型效果。技术方法：SNPscan®是由上海天昊生物科技有限公司自主专利开发的多重SNP分型专利技术，能在一个检测流程中同时实现对48/96/144/192个SNP位点进行分型。该技术基本原理是采用连接酶连接反应的高特异性实现对SNP位点等位基因的识别，然后通过在连接探针末段引入不同长度的非特异序列以及通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物，利用标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增，通过荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离，最后通过对GeneMapper软件分析获取各个SNP位点的基因型。应用领域：本方法可涉及到多个需要SNP分型的遗传研究领域。适合对于大量候选生物通路或者候选染色体区域的基因SNP分型，尤其适合针对全基因组SNP关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。超高通量目的SNP分型技术-SNPseq高效快速：每个反应可以实现数千个SNP位点分型检测，同时可将上千个样本标记混在一起检测，1台Illumina®Hiseq2500可以在3天之内完成800万个分型，而常规芯片只能单个或数个样本同时检测。应用领域：本方法适用于很多的遗传研究领域，例如疾病基因组研究、肿瘤基因组研究、临床分子诊断研究、植物动物基因组研究等，尤其适合大规模样品多基因复杂性状表型的相关基因的确定、肿瘤基因组体细胞突变研究等。SNP介绍：单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs），即指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，这就是SNP。由于SNP在人类基因组中数量较多，发生频率较高，因此被认为是继微卫星之后的新一代遗传学标记，在医学遗传学、药物遗传学、疾病遗传学、疾病诊断学、以及人类进化等研究领域都有着很高的研究价值和应用前景。上海邃志生物科技在SNP位点分析和研究方面积累了丰富的经验，拥有开展SNP研究的先进仪器设备，具有自己独到的研究策略和方法，并且已经建立大样本量人群的SNP基础数据库，能通过这些资源的有效挖掘，更好地帮助客户开展SNP方面的研究工作，包括SNP的功能学研究。SNP检测技术介绍及比较：质谱分析法（massspectrometry）该方法利用质谱分析对质量的灵敏度特别高的特点,很容易将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开的特点,使用质谱直接或间接检测等位基因特异性延伸区的反应产物,推导出SNP。单碱基延伸或其修饰形式与基质辅助激光吸收/离子飞行时间(MALDI-TOF)质谱结合已被广泛的应用,并已被美国公司(Sequenom)发展为商业性产品。我公司提供的SNP检测技术服务，就是基于这样的方法。DNA芯片技术（DNAchip）将已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜检测两种DNA分子产生的荧光信号，确定是否存在突变。限制性片段长度多态性分析法(RFLP)RFLP技术利用限制性核酸内切酶识别并剪切特定DNA序列的能力,检测基因片段上限制性核酸内切酶识别位点处是否存在核苷酸突变。应用限制性内切酶对两个等位基因识别的差异,产生不同大小的切割片段,通过电泳迁移率的不同来判定是否存在SNP。实时荧光PCR分析法使用针对核酸中不同多态性序列的荧光Taqman探针，它们在PCR扩增中被水解释放荧光信号，只有与靶序列完全匹配的探针才能被相应的切割。不同探针标记不同的荧光报道信号。利用多通道荧光PCR仪检测结果，可以便捷判断核酸多态性。单链构象多态性分析法（SSCP）在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。DNA测序法（DNAsequencing）双脱氧终止法，引物用四种不同前颜色的荧光标记，使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行。