多杀菌素的生物合成

多杀菌素的研究及其在储粮害虫防治中的应用张晓琳1曹阳宋渊郭伟群2（1.国家粮食局科学研究院，100037；2.中国农业大学国家农业生物技术重点实验室，100094）摘要多杀菌素（spinosad）是一种具有触杀和摄食毒性的广谱生物杀虫剂，能有效防治多种储粮害虫、应用剂量低、持效期长、低残留、无交互抗性，具有对害虫高效、对环境安全、对哺乳动物低毒的优异特点。因而被认为是一种极具前景的“绿色”储粮防护剂。文中就多杀菌素的结构、理化性质、作用机理和生物活性、发酵生产技术以及在储粮害虫防治中的应用等进行了综述。关键词多杀菌素多刺糖多孢菌生物杀虫剂储粮防护剂虫害是导致储粮数量损耗，引起粮食霉变，降低粮食品质的主要因素[1]。我国目前对储粮害虫的防治主要依赖于化学药剂。但是长期大量使用化学药剂，一方面导致了储粮害虫普遍对化学药剂产生抗性[2]；另一方面，有的杀虫剂影响非靶标昆虫，某些益虫被无意中消灭，导致其次要害虫急剧增长，产生灾难性后果；更重要的是化学药剂残留的问题日趋严重，不仅造成了严重的环境污染，而且给人类的健康带来巨大的威胁[3]。为此，各国科学家都试图去寻找一种新型安全的杀虫药剂来防治储粮害虫。多杀菌素（spinosad）是一种具有触杀及摄食毒性的新型微生物源杀虫剂，具有对害虫广谱高效、对人、非靶标动物和环境极为安全、可生物降解的优异特点，并因此获得美国“总统绿色化学品挑战奖”[4,5]。多杀菌素首先于1997年在美国被批准登记，商品名为Tracer，用在棉花上。2005年，多杀菌素已经被批准用于73个国家的250多种作物上。由于多杀菌素能有效防治多种储粮害虫、用药量极少、持效期长、安全高效、低残留，因而被认为是一种极具前景的“绿色”储粮防护剂。2005年美国已批准多杀菌素用于存储谷物与种子保护。目前，国内对多杀菌素的研究尚处于试验阶段。1多杀菌素的结构多杀菌素，又名刺糖菌素，是由土壤放线菌多刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)发酵产生的次级代谢产物[6]。如图1所示，多杀菌素为新型大环内酯类抗生素，但和一般的大环内酯类抗生素相反，多杀菌素没有抑菌活性，却有杀虫活性[6]。张晓琳，国家粮食局科学研究院，博士，抗生素发酵和基因工程研究，北京市西城区百万庄大街11号，[e-mail]。1990年，Boeck等人[7]首次从刺糖多孢菌NRRL-18395的天然发酵产物中分离出了多杀菌素组份spinosynA,B,C,D,E,F,H,J和多杀菌素A拟糖苷配基，其中多杀菌素A(spinosynA)组份约占85%~90%，多杀菌素D(spinosynD)组份约占10%~15%，其余均为次要组分。到目前为止，另外还发现了15种多杀菌素类化合物[8-10]，包括组份K,L,M,N,O,P,Q,R,S,T,U,V,W,Y。多杀菌素的母核是由一个5,6,5-顺-反-顺三环和一个十二元的内酯环粘合而成，并通过糖苷键连接着两个不同的六元糖，其中一个是氨基糖β-D-福乐糖胺(D-forosamine)，另一个是中性糖α-L-鼠李糖(L-rhamnose)。多杀菌素不同组份的区别主要在于两个糖基上的N-和O-甲基化的不同或母核上C-甲基化的不同[11,12]。2多杀菌素的理化性质[4,8]纯的多杀菌素为白色或浅灰白色的固体结晶，带有一种类似于轻微陈腐泥土的气味，是85%~88%的多杀菌素A组份和12%~15%的多杀菌素D组份的混合物。多杀菌素不易溶于水，易溶于有机溶剂，例如：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、二甲基亚砜及二甲基甲酰胺等。在水溶液中pH值为7.74，对金属和金属离子在28天内相对稳定,商业化产品的保质期为3年。多杀菌素在空气中不易挥发。表1概括了多杀菌素A和D的一些物理、化学性质。多杀菌素在环境中通过多种途径组合的方式进行降解,主要为光降解和微生物降解,最终变成碳、氢、氧、氮等自然组份。由土壤光解作用降解的多杀菌素半衰期为9~10天，而水光解作用的半衰期则小于1天，叶面光降解的半衰期是1.6～6天。在无光照条件下多杀菌素经有氧土壤代谢的半衰期为9～17天。另外多杀菌素的沥滤性图1多杀菌素的结构图能非常低，合理使用不会对地下水构成威胁。表1多杀菌素A和D的物理与化学性质多杀菌素A多杀菌素D相对分子量731.98746.00经验分子式C42H67NO16C41H65NO16熔点(℃)84～99.5161.5～170蒸汽压(Pa)3.2×10-102.1×10-10水中溶解度(mg/L)pH5.029029pH7.02350.332pH9.0160.053正辛醇/水分配系数(logP)pH5.02.83.2pH7.04.04.5pH9.05.25.23多杀菌素的作用机理和生物学性质3.1多杀菌素的作用机理和抗性治理多杀菌素具有全新的作用机理[13]，它并不作用于乙酰胆碱酯酶和Na＋通道，使之不同于传统的有机磷和拟除虫菊酯类杀虫剂。实验证明它对昆虫存在快速触杀和摄食毒性。它的作用方式是通过刺激昆虫的神经系统，导致非功能性的肌收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹。这种作用结果和烟碱型乙酰胆碱受体被激活的结果是相一致的，显而易见这一作用机制在已知的害虫防治产品中是新颖和独特的。多杀菌素同时也作用于γ-氨基丁酸受体，有可能这进一步促成了其杀虫活性的提高，如此的作用模式可谓独一无二[12]。吡虫啉和其他的烟碱性受体类的杀虫剂与多杀菌素的作用位点是不相同的。阿维菌素尽管也是一个天然产物，且同为大环内酯类，但其作用位点亦和多杀菌素不尽相同。迄今为止，尚未发现某类产品能以相同的作用方式影响昆虫的神经系统，而且尚无有关多杀菌素交叉抗性的报道。多杀菌素具有独特的杀虫作用机制，符合抗性治理的理念，与现存化学药剂无交互抗性，可以与现有的虫害防治产品轮换应用。此外，多杀菌素对捕食性昆虫具有选择性，以及适度的残留特性，这些都大大降低了抗性发展的可能性。但是正如不断增长的杀虫剂抗性发生数量所表明的那样，昆虫的普遍适应性已经一而再地被证明。因此要加强多杀菌素抗性治理方面的研究，根据不同作物、害虫种类、地理区域差异，对主要害虫进行专门的抗性治理战略。3.2多杀菌素的杀虫谱和毒性多杀菌素属广谱杀虫剂，试验证明多杀菌素能有效地控制鳞翅目、双翅目和缨翅目害虫,另外它还可以很好地防治鞘翅目和直翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类[14-16]。多杀菌素对鳞翅目幼虫的活性大大地大于各种有机磷、氨基甲酸酯杀虫剂，与拟除虫菊酯相当。多杀菌素具有高杀虫活性的同时,对捕食性昆虫还表现出较低毒性,对鳞翅目昆虫而言,多杀菌素是已发现的杀虫剂中选择性最高的化合物之一。此外，多杀菌素对蓟马、虱、白蚁以及许多膜翅目害虫也有较好的效果。根据中国农药毒性分级标准，多杀菌素属低毒杀虫剂。它对哺乳动物和鸟类相对低毒，对水生动物也只是轻微的中等毒性。另外,对哺乳动物的慢性毒理试验表明多杀菌素无致畸、致突变、致癌作用或神经毒性[17]。表2数据表明，多杀菌素的用量和毒性均低于目前常用的几种储粮杀虫剂。同时，多杀菌素对许多益虫和有益生物也具有很高的安全阈界，相比之下它对捕食性甲虫、口器昆虫、草蛉和螨类毒性较低。较之传统的氯氰菊酯,多杀菌素对一些重要的有益昆虫都显示出较低的杀虫活性,而在防治鳞翅目害虫时,多杀菌素和氯氰菊酯两者的活性强度通常不相上下[18]。因此，多杀菌素是进行害虫综合治理的首选。表2多杀菌素与其它储粮杀虫剂的毒性比较特性多杀菌素甲基溴杀螟松磷化氢用量1ppm6－8ppm2ppmNA急性口服毒性LD503783－5000mg/kg（大鼠）1414mg/kg(老鼠)500-900mg/kg8.7-45.7mg/kg(老鼠)急性皮肤毒性LD502000mg/kg（兔子）2000mg/kg（老鼠）5000mg/kg（老鼠）2000-5000mg/kg（兔子）禽类急性口服毒性LD502000mg/kg（麻鸭）1695mg/kg（麻鸭）2000mg/kg（鹌鹑）37.5mg/kg（麻鸭）鱼类急性口服毒性LD5030ppm（虹鳟鱼）0.64ppm（虹鳟鱼）0.6－2.9×10-3ppm（虹鳟鱼）9.7×10-3ppm（虹鳟鱼）4多杀菌素的发酵生产技术利用放线菌多刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的研究在国内还处于起步阶段，产素水平比较低，距工业化生产还有较大的距离。4.1多杀菌素产生菌株的选育4.1.1菌种特性[19]多刺糖多孢菌是好氧型革兰氏阳性放线菌,它是由一位化学家在加勒比海度假时从一个废弃的糖蜜酒厂附近土壤中分离得到的，通过对其发酵液的抗蚊虫幼虫活性测定发现了多杀菌素。多刺糖多孢菌NRRL18395在大多数培养基（如YMS、ATCC174、苹果酸钙等）上都能生长良好，形成气生菌丝体。气生菌丝为粉黄色，营养菌丝为黄色到黄褐色，产浅粉黄色孢子，在某些培养基上则产生白色孢子。孢子链外观为珠状，有孢子壳，孢子壳表面为针状，这些针状物约1mm，环绕在末端上。孢子形状为椭圆形，平均大小约为1.1×1.5μm。孢子链长度大大超过50个孢子。菌体生长温度为15℃～37℃,对溶菌酶敏感，在高渗条件下（11%NaCl）可以生长。4.1.2菌种选育与其它抗生素产生菌一样，多杀菌素产生菌的产素水平主要也决定于环境条件和自身的遗传因子两个方面。改良发酵条件只能在较低水平上提高目的菌株的产素水平，通过高产菌株育种技术改变菌株的部分遗传信息，能有效地提高目的菌株的产素水平。多种育种方式的交替使用将有助于抗生素产素潜力的发挥[21]。常规诱变方法作为一种经典的传统诱变方法，在抗生素发展史上有其光辉及重要的位置。特别是在一些抗生素产生菌的遗传背景和生物合成途径尚未清楚的情况下，这种传统的诱变方法仍是提高产量、改变菌种不良性状的有效手段。刺糖多孢菌作为一种新型大环内酯类抗生素的产生菌，遗传背景和生物合成途径尚未搞清楚，故一般采用常规诱变方法进行菌种选育。目前国内学者在刺糖多孢菌菌种选育中常用的常规诱变方法主要有：紫外（UV）诱变，UV和氯化锂（LiCl）复合诱变，硫酸二乙酯（DES）诱变，亚硝基胍（NTG）诱变，DES和LiCl复合诱变，60Co诱变等[20-22]。4.2多杀菌素发酵培养研究提高多杀菌素产量可以从两个方面着手，一是诱变育种改变菌种的遗传背景，获得高产菌种；二是给菌种一个最适发酵培养条件，使其产生高效价的性状得以充分表达。4.2.1多杀菌素的摇瓶发酵将保藏于冷冻干燥管或液氮安瓿瓶中的菌种转接斜面或平皿，斜面培养基及平皿分离培养基为：酪蛋白水解物，牛肉膏，葡萄糖，琼脂。接种后的斜面28℃培养8～10天后接种于种子摇瓶。摇瓶种子培养基为：葡萄糖，淀粉，精氨酸，黄豆粉，玉米浆，酵母浸出粉，CaCO3，pH6.3。摇瓶装量为500m1三角瓶装100ml培养基，28℃于旋转式摇床(偏心距4cm)160r／min培养72h。之后以5%的接种量接种于摇瓶发酵培养基。摇瓶发酵培养基为：葡萄糖，淀粉，精氨酸，黄豆粉，玉米浆，酵母浸出粉，CaCO3，pH7.0。装量同种子摇瓶，28℃于同条件摇床上培养6～8d。用于产物的测定或分离纯化[20]。4.2.2多杀菌素的搅拌式生物反应器发酵用来培养多刺糖多孢菌生产多杀菌素的培养基可以是多种培养基中的任意一种，但是从生产的经济、产率和产物易分离的角度看，需要优选出某些培养基。例如：大规模发酵时优选的碳源为葡萄糖和麦芽糖，但也可使用核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、可溶性淀粉、土豆糊精、油酸甲酯、油类等。优选的氮源为棉子糖、胨化牛奶和消化大豆粉，也可使用鱼粉、玉米浸膏、酵母膏、酪蛋白水解物、牛肉膏等。可掺入培养基中的营养可溶无机盐离子有锌离子、钠离子、镁离子、铵离子、氯离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子等。菌体生长的必需微量元素一般作为杂质存在于培养基的其它成分中，其含量足以满足微生物的生长需要。常规消泡剂会抑制多杀菌素的产生。如有发泡问题，可以在培养基中加入少量豆油。刺糖多孢菌产多杀菌素的最适温度为28℃～30℃。由于多杀菌素的生产是一