ST细胞在反应器上的培养

ST细胞在反应器上的培养一、上反应器前细胞培养1.器具及试剂1.1器具：移液器、移液器吸头、培养转瓶、倒置显微镜、废液缸、镊子、酒精棉、酒精灯等。1.2试剂：0.25%胰酶、培养基（DMEM）、牛血清等。2.细胞传代2.1将已长成单层细胞的培养瓶中的培养液弃去。2.2用适量消化液（0.25%胰酶）洗一次，应使胰酶洗遍所有细胞表面，弃去消化液。2.3再次加入适量消化液（0.25%胰酶），轻轻摇动使胰酶流遍所有细胞表面约1-2分钟后再倒掉大部分消化液，仅留少许消化液进行消化。2.437℃或室温下作用1-5分钟至看到有部分细胞从瓶壁流下至大部分细胞从瓶壁上脱落时立即加入适量培养液（含10%小牛血清）终止消化作用，同时制成（1-2）×105个/ml细胞悬液。2.5将细胞悬液移入培养瓶中，接种6个转瓶，以橡胶塞封口，并作好标记。2.6移入转瓶机，10r/h，37℃培养。二、反应器上细胞培养1.前期准备：1.1反应器耗材:5L灌注培养袋、5L激流培养袋、取样器、呼吸袋1.2器具：移液器、移液器吸头、取样管、倒置显微镜、废液缸、镊子、酒精棉、酒精灯、水浴锅，紫外分光光度计等。1.3试剂：葡萄糖测定试剂盒、DMEM、CS、7.5%碳酸氢钠溶液、200g/L葡萄糖溶液等。1.4反应袋、培养袋气密性的检查：在百级超净工作台或十万级以上洁净区域中，拆开包装，检查所有管接、丝堵是否都已经扎紧、拧紧。用卡板卡死除空气过滤管外所有管路（确保不漏气），空气过滤器连接三通。三通中的一路接压力表（0-25KPa），另一路作进气用。启动气泵(设备自带)，通过进气管的空气过滤器向培养袋中缓慢充气，以避免局部压力过大造成破裂。（空气过滤器内滤膜最大受压为4.1bar）。充气压力达到5KPa时立即停止充气，压力值最多不得超过规定值的10%。袋子保压12小时或以上，检查袋子的泄压情况。1.5配制10LPBS，装入有链接头的桶中高压灭菌。（PBS配方：NaCl：8.00g/L、KCl：0.20g/L、Na2HPO4：1.44g/L、KH2PO4：0.24g/L）2.检查反应袋和培养袋的气密性，气密性良好，无菌操作下链接反应袋进液头和PBS桶，打入3.0LPBS，同时排尽反应袋中空气，将纸片浸泡到PBS中，浸泡过夜。（浸泡PBS目的：浸润纸片，以便洗掉纸片上粘附的纸屑，避免将来影响细胞贴附生长。不用培养液浸润，是为了节省原料，减轻成本。）3.电极校正3.1温度电极校正：拧开灭菌筒，垂直拿出温度电极，用纯化水清洗干净，用滤纸吸干水分，将温度电极与控制柜上的温度电极线连接起来，用管理员权限登录控制系统，切换到电极校正界面。将温度电极和标准温度计同时放入一杯常温水中，电极探头和温度探头尽量靠近，但不能接触。稳定后读取温度计上的数据，并将此数据设定为显示屏上温度的数值。再把标准温度计和温度电极放入50℃左右的温水中，稳定后读取温度计上的数据，并将该数据设定为显示屏上温度的数值。重复上述校正步骤，在不同温度的水中来回校正几次，直到温度计上的数值与显示屏上温度的数值相符。取下温度电极，擦干后垂直放回灭菌筒。3.2PH电极校正：打开灭菌筒，垂直拿出PH电极，用纯化水清洗干净，轻轻用滤纸吸干水分（切勿摩擦PH敏感膜）。将PH电极与控制柜上的电极线连接起来，把PH电极放入PH为4.01的标准校正液中，待后显示屏上PH数值稳定在4.01后，设定前显示屏上PH数值为4.01。将PH电极清洗拭干后放入PH为7.00的标准校正液中，待后显示屏PH数值稳定在7.00后，设定前显示屏上PH数值为7.00。校正完成，取下PH电极，清洗拭干后垂直放回灭菌筒。3.3溶氧电极校正：打开灭菌筒，垂直拿出溶氧电极，将溶氧电极与控制柜上的电极线连接起来，活化6个小时。将溶氧电极放入无氧水中，待后显示屏上溶氧数值为0后，设定前显示屏上溶氧数值为0。把电极清洗拭干后暴露于空气中，待后显示屏上溶氧数值达到100%后，设定前显示屏溶氧数值为100%。校正完成，取下电极，垂直放回灭菌筒中。（附：短期保存时，三个电极都浸泡在饱和KCl溶液中。长期保存时，PH电极用纯化水清洗干净后，将电极头部浸泡在饱和KCl溶液中，放在灭菌筒内。溶氧电极用纯化水清洗干净后，沥干放在电极包装盒中。温度电极一般不需要清洗，妥善放置即可。）4.电极校正完成后，将电极高压灭菌（121℃灭菌30min），准备一部分的链接接头，大小转换接头，带有连接头的特制转瓶胶塞2-3套。高压好一套有连接头的废液桶（10L）。5.无菌操作下链接好废液桶和反应袋出液端、PBS桶和反应袋进液端，将反应袋中的PBS打出到废液桶中，打入新的PBS，洗掉纸屑，再将PBS打出到废液桶。无菌操作下断开PBS桶与进液端的链接头，链接好装有含少量血清培养液的转瓶和进液端，打入3.5L培养液润洗。然后开始消化六个转瓶细胞，细胞消化好收集在一起，加10%血清DMEM培养液至3L，装上特制胶塞，将反应袋中培养液打出，无菌操作下连接好管路，将细胞悬液打入到反应袋中，卡死所有管路，断开链接，反应袋放入37℃温室吸附1.5-2小时，每半小时反转90度。无菌操作下，将高压灭菌处理好的电极安装到培养袋中，将培养袋安装到振荡器上，理清管路，安装好排气袋（酒精袋），反应袋打入4.5L10%血清培养液，打液过程中，调节压缩空气阀门，保持培养袋内为正压，启动加热系统，将培养液预热到37℃，反应袋细胞吸附完成，将反应袋安装到反应器上，培养袋连接7.5%碳酸氢钠溶液瓶，连接进出液管道，进液管连到蠕动泵，开始循环，检查管路是否漏液，将参数设定好，培养罐温度设为37.0，反应罐温度设为36.5，PH设为7.0-7.2，Do设为60-120，摇床转速设为55r/min，调整为自动模式，监控PH、溶氧、温度。30min后取样，测定原始糖含量。6.每隔六小时取样测糖一次，分析耗糖变化情况，当耗糖变化突然下降，稳定几乎不耗糖时，可认定，反应器内细胞已经长满。7.停止循环，打出全部培养液到废液桶。取下反应袋，打入PBS冲洗一次，打出PBS。打入适量胰酶消化细胞，将细胞打出到瓶子里，加血清终止消化。8.平板细胞计数法计算细胞总数。