TagDNA酶纯化方法

快速纯化DNA聚合酶细菌培养：1．选取单个菌落在LB（含有Amp80ug/mL）培养基中过夜培养。2．接种500uL过夜培养物到750mLLB（含有Amp80ug/mL）培养基中在2000mL培养瓶中。总共培养3×750mL。3．37℃培养12小时到OD600=0.8摇床速度为不低于200rpm。4．加入IPTG(储存浓度为100mM)至终浓度为0.5mM，大约需要10mLIPTG5．继续培养10小时，不要超过12小时。收获细菌：1．在GS3转子在5000rpm离心20分钟，弃上清。2．用bufferA每管加入100mL洗涤细菌沉淀。bufferA配方：50mMTris-HCL,pH7.950mMdextrose（葡萄糖）1mMEDTA3．5000rpm离心细菌裂解细菌：1．制作新鲜前裂解buffer(BufferA+4mg/mL融菌酶)2．在每个离心管中加入50mL前裂解buffer重悬细菌，细菌应该完全重悬，不应该有团块。3．室温下孵育15分钟。4．加入相等体积的裂解buffer(lysisbuffer)，其配方为：20mMTris-HCL,pH7.9;5050mMKCL1mMEDTA1mMPMSF0.5%Tween200.5%NP40如果配置100mL(Tris-HCL2mL；KCL5mL；0．2mLEDTA；PMSF0.2mL10%Tween205mL;10%NP405mL)5．很好的混匀，溶菌液将是黏性的。6．将所有的溶菌液转移到1－2个塑料瓶中7．孵育全部200mL裂解液在75℃水浴1小时。分离Tag酶；澄清裂解混合物：1．4℃15000rpm离心10分钟2．将上清加到SW28转子超速离心管中（35mL/管）3．4℃26000rpm离心45分钟（注意超离这步可以不作如果能看到1离下来沉淀）硫酸铵沉淀：1．转移澄清的裂解产物大约200mL到一个干净的瓶子。2．每一百毫升裂解产物慢慢加入30g硫酸铵粉末，在室温下快速搅动。硫酸铵的用量大约为50－60g，依赖于裂解产物的体积。3．加入一半的硫酸铵后透明的裂解产物变成牛奶状，4℃15000rpm离心10分钟4．收获蛋白沉淀5．重悬蛋白沉淀，每100mL最初的裂解产物用20mLbufferB重悬。BufferB配方：50mMTris-HCL,pH7.9;50mMKCL0．1mMEDTA1mMDTT0.1mMPMSF两步透析：1．在bufferC中透析12小时。BufferC配方：50mMTris-HCL,pH7.9;50mMKCL0．1mMEDTA1mMDTT0.5mMPMSF2．第一次透析后，一定会有沉淀，这时4℃15000rpm离心30分钟，来澄清第一次透析产物。3．重新将上清装入透析袋，在储藏透析缓冲液中过夜。这时你能浓缩Tag酶3倍。储藏透析缓冲液配方：bufferC＋50％甘油用商品Tag酶来测定你制作的Tag酶活性：注意：1．大肠杆菌菌株：INFalphaF2．过渡培养的细菌导致Tag酶降解。纯化蛋白的过程：诱导提蛋白：600ml重组菌+600μlIPTG诱导2.5h，6000rpm离心10分钟后冻存。1．细胞以每克湿重2-5ml裂解缓冲液重悬。2．加入溶菌酶(50mg/ml)至终浓度1mg/ml，冰浴30min。3．冰上超声。10秒+106个循环，300W，用小超声头。4．若裂解液粘稠，加入RNaseA(10μg/ml)和DNaseI(5μg/ml)冰浴10~15min。5．1000g离心20~30min(4℃)，取上清。(上清留样电泳)6．将1ml50%，Ni-NTA匀浆于4ml澄清裂解液中，于200rpm旋转摇床轻摇混匀，4℃,60min。7．将裂解液-Ni-NTA混和物上柱。8．取流出液电泳分析。9．以4mlwashbuffer洗两次，留样电泳分析。10．以0.5mlelutionbuffer洗脱蛋白4次，于四个tube收集，电泳分析。(1)lysisbuffer：(bufferA)(1L)pH=8.0用NaOH调50mMNaH2PO47.8gNaH2PO4.2H2O(156.01)6.9gNaH2PO4.H2O(137.99)300mMNaCl17.54gNaCl(58.44)10mMimidazole0.68gimidazold(68.08)(实配1mM)(2)washbuffer:(bufferB)(1L)pH=8.050mMNaH2PO47.8gNaH2PO4.2H2O300mMNaCl17.54gNaCl20mMimidazole1.36gimidazole(实配1mM)(3)elutionbuffer:(bufferC)(1L)pH=8.050mMNaH2PO4300mMNaCl250mMimidazole17.00g(4)bufferABC成份可根据特殊情况稍作修改，imidazole含量可根据蛋白与柱结合情况调整，(A中)结合弱可1-5mM，结合强可20mM。可加入0.1%Tween，5~10mMβ-ME，1mMPMSF或增加NaCl，甘油离心。(5)使用完以10倍体积0.2M乙酸，30%甘油和水依次清洗，保存于30%乙醇中防微生物生长。Ni-NTA活化：推荐5次/柱，若由浅兰变棕灰，则再生如下：建议流速0.5ml/min。1．以2倍体积的再生缓冲液清洗(6MGuCl，0.2Maceticacid)2．以5倍体积的H2O冲洗。3．3倍体积的2%SDS冲洗。4．1倍体积25%乙醇洗。5．1倍体积50%乙醇洗。6．1倍体积.75%乙醇洗。7．5倍体积100%乙醇洗。8．1倍体积.75%乙醇洗。9．1倍体积50%乙醇洗。10．1倍体积25%乙醇洗。11．1倍体积水清洗。12．5倍体积100mMEDTA(pH8.0)洗。13．水洗。14．2倍体积100mMNiSO4洗。15．2倍体积水洗。16．2倍体积再生缓冲液洗。17．2倍体积bufferA或B平衡。18．30%乙醇与beads等体积保存于4℃。