western-blot-教学

蛋白质的电泳分析SDS-PAGE&WesternBlot蛋白组学平台提问：RT-PCR、WB、免疫组化、FCM、ELISA、Bio-plex用来检测什么？有何区别？SDS-PAGE蛋白分析的利器；Western既可以定性，又可以半定量,是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。WesternBlot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。是检测混合样品中单一特定蛋白的常用技术。灵敏度可以达到1-5pg.研究检测样品中特异性蛋白质的存在细胞中特异蛋白质的半定量分析蛋白质分子的相互作用研究WesternBlot应用蛋白样品制备SDS-PAGE转膜抗体检测化学发光成像蛋白样品制备1蛋白抽提方法物理方法反复冻融机械搅拌超声研磨酶解法(裂解酶)化学方法自溶法去污剂总蛋白的提取•材料：HT-29细胞（收集25cm培养瓶一瓶）•试剂：RIPA蛋白抽提试剂（裂解液有多种，根据需要选择）•检测beta-actin，分子量43KDa•注意：为防止蛋白酶对蛋白的降解，提前前需加入1xcoaktail(含PMSF)，冰中操作。PMSF:丝氨酸蛋白酶抑制剂【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。如有必要可配成浓度高达17.4mg/ml的贮存液（100mmol/L）。【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。PMSF在水中不稳定，故需在使用前再加PMSF；PMSF低温时会有冰晶，用时要摇匀至无结晶。ProcedureforLysisofMonolayer-culturedMammalianCellsNote:Ifdesired,addproteaseandphosphataseinhibitorstotheRIPABufferimmediatelybeforeuse.1.Carefullyremove(decant)culturemediumfromadherentcells.2.WashcellstwicewithcoldPBS.3.AddcoldRIPABuffertothecells.Use1mLofbufferper75cm2flaskcontaining5×106HeLaorA431cells.Keeponicefor5minutes,swirlingtheplateoccasionallyforuniformspreading.4.Gatherthelysatetoonesideusingacellscraper,collectthelysateandtransfertoamicrocentrifugetube.Centrifugesamplesat~14,000×gfor15minutestopelletthecelldebris.Note:Toincreaseyields,sonicatethepelletfor30secondswith50%pulse.5.Transfersupernatanttoanewtubeforfurtheranalysis.Protocol1、贴壁细胞，去培养基，加入2ml预冷的PBS，洗2-3次，最后移至EP管中，用滤纸弃干水分，25cm培养瓶一瓶加入120µL配好的含多种酶抑制剂的RIPA裂解液，用枪头轻轻将细胞吹散，放在冰上裂解20-30min，期间可以用手弹一弹管子或者振荡数次以使细胞裂解充分。（注意不要引起过多气泡以免蛋白降解）。裂解完，14000转，4℃离心15分钟。取上清即得所需总蛋白。组织样品：按100mg组织加1ml的RIPA裂解液（含酶抑制剂），用玻璃匀浆器匀浆。冰中裂解，余同上。如果有些样品提时发现粘度较大（粘是因为含核酸多），可置于冰中进行超声数次；或者加核酸酶以降解核酸。提完蛋白请分装（分装时一定要保证蛋白混合均匀），-80℃保存备用。注意：不要全部变性，留些为变性的蛋白置于-80℃，以备用。如果是检测磷酸化蛋白则提取时要加磷酸酶抑制剂。方法灵敏度时间原理干扰物质说明双缩脲法灵敏度低中速，20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋生成紫色络合物硫酸铵、Tris缓冲液、某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏快速，5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正；不消耗样品，测定后样品仍能回收利用Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高慢速，40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化;标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度更高快速，5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其lmax由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS较好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化;标准曲线有轻微的非线性BCA法灵敏度非常高较快速40分钟内在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+螯合剂；略高浓度的还原剂抗干扰能力强，蛋白不可逆的变性•在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+络合，将Cu2+还原成Cu+。•BCA试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色复合物。•在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。•绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。定量完用裂解液/高纯水根据测出的浓度将各种蛋白调至等体积，一般可调至上样量为10-15µLPierceBCAProteinAssayKit(ProductNo23225).蛋白样品与上样缓冲液（5x）按4:1的比例混合后，放在100℃加热器中加热3-5min（提前开机预热），充分变性蛋白后迅速降温，离心，一周内要做的存至-20℃，一个月内要做的放于-80℃冰箱。如果蛋白浓度很高的话也可以选择蛋白上样缓冲液（2x）。SDS-PAGE21、应用于提纯过程中纯度的检测2、用于分子量的检测3、蛋白浓度测定（只跑浓缩胶，用已知浓度BSA对比）SDS-PAGE的应用SDS-PAGE原理SDS•SDS与蛋白结合后，还可引起构象改变，复合物呈长椭圆棒，SDS-PAGE只取决于蛋白分子量大小。•SDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamideGelElectrophoresis•丙烯酰胺(A)：形成聚合物链•N,N’-亚甲双丙烯酰胺(B)：形成纵向架桥（cross-linkage）•过硫酸铵(APS，Ammoniumpersulfate)：助凝剂•TEMED(si)：催化剂O∥CH2=CH–C–NH2OO∥∥CH2=CH–C–NH–CH2–NH–C–CH=CH2︱CONH2CONH2CONH︱︱︱–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH–︱CONH︱CH2︱CONHCONH2CONH2︱︱︱–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH–︱CONH︱APS,TEMED(神经毒性)AB1、30%丙烯酰胺储备胶溶液2、1.5MTris-HCl(pH8.8)3、1MTris-HCl(pH6.8)4、10%SDS5、10%过硫酸铵（AP）6、TEMED(N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺)7、2SDS电泳上样缓冲液8、ddH2O聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择Tris-HCl系统，具体作用后面介绍；TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠（部分）。浓缩胶分离胶5%pH6.812%pH8.8蛋白质在进入分离胶以前，先被浓缩成一条细线，使每个蛋白的起跑线相同，提高解析度。1.pH不连续2.凝胶不连续3.缓冲液成分不连续特点：SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围6%50-150kD8%30-90kD10%20-80kD12%12-60kD15%10-40kD分离胶孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，可以使样品很好的分离。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。pH对整个制胶体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。总体积：5mlddH2O2.0ml30%储备胶1.65ml1.5MTris-HCl(pH8.0)1.25ml10%SDS0.05ml10%AP0.05ml混匀上述液体后加4µl的TEMEDSDS低温（10℃）下会结晶，冬天配胶时应注意。1、清洗玻璃板，如果是第一次使用的波板，应用洗衣粉泡，超声，自来水冲洗完再用蒸馏水冲洗直至不挂水珠，晾干，装胶板，加入蒸馏水，静置10min观察是否会漏水，然后倒掉超纯水，用滤纸吸干，应尽量吸干。2、制胶（5+2）：根据蛋白分子量大小配好分离胶：12%分离胶常用按顺序加入各试剂至离心管中，加AP（10%）后，轻轻混匀，之后加TEMED迅速上胶，灌胶待胶面升到绿带中间线高度时即可，然后加满正丁醇/乙醇封住（为了使分离胶界面保持水平，将胶压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；并且阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用），让胶自然凝固。3、待分离胶完全凝固后（约45－60min），倒去正丁醇/乙醇，用超纯水冲洗干净，滤纸吸干残留水滴。4、加入浓缩胶至溢出，插入样品梳（稍微倾斜插入以减少气泡的产生），让胶自然凝固。5、收胶：胶放在电泳液/水中于4度冰箱保存，拿出来用时恢复到室温。配胶操作时要使两玻璃对齐，左、右、底三边无间隙，尤其注意底边平齐，以免漏胶。未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，要带手套并小心操作。灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度，操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水或饱和正丁醇液封时要很慢，否则胶会被冲变型。室温25℃下凝胶完全聚合约需30-60min。积层/浓缩胶（4%）的配制总体积：2mlddH2O1.4ml30%储备胶0.33ml1MTris-HCl(pH6.8)0.25ml10%SDS0.02ml10%AP0.02ml混匀后最后加TEMED2µl将混合液迅速加入玻璃板间隙，并立即插入梳子插梳子时要使梳子保持水平并小心避免混入气泡。由于胶凝固时体积会收缩减小，会使加样孔变形，所以在浓缩胶凝固的过程中要不断补充浓缩胶溶液使之充满梳子间的空隙。2SDS上样缓冲液：1MTris-HCl(pH6.8)2.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS0.6g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O3.5ml。(缓冲液中溴酚兰染料，使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；甘油还能够增大样品密度，以确保样品均匀进入样品孔内；SDS使蛋白变性并带上负电荷；-巯基乙醇还原蛋白。)如果蛋白浓度偏低则选择5SDS电泳上样缓冲液蛋白样品与上样缓冲液（5x）按4:1的比例混合后，放在100℃加热器中加热3-5min（提前开机预热），充分变性蛋白后迅速降温，离心，一周内要做的存至-20℃，一个月内要做的放于-80℃冰箱。为了防爆管可在离心管上放冰块。四、电泳1、将胶板装入电泳槽中，拔出样品梳（拔出来尽量小心,不要破坏加样孔,如有胶丝可用毛细血管枪头挑出），清洗泳道。2、将样品放置在冰上，融化后先离心，然后在振荡器上混匀，上样，上样量10-50ug，一孔加marker，在边缘孔中加入等体积的１Ｘ上样缓冲液，以避免边缘效应。3、