Westernbloting-蛋白印迹技术

蛋白印迹技术（Westernbloting）1细胞总蛋白的提取（1）配置细胞裂解液：将RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂100:1充分混合备用。（2）裂解细胞：收集细胞，PBS洗3遍，弃尽上清，根据细胞数加适量细胞裂解液，轻轻吹打混匀，冰浴30分钟，每隔10分钟吹打一次使细胞充分裂解。（3）将细胞联通裂解液转移至EP管，12000rpm,4℃，离心5min。（4）取5μL上清液用于蛋白定量，其余上清液按3:1加入4×SDS蛋白上样缓冲液，混勻后，在沸水浴中煮5min，12000rpm,4℃，离心1min，分装，-80℃冰箱保存备用。（5）蛋白定量：将2mg/mL的BSA标准品按下表稀释：VialVolumeofDiluentVolumeandSourceofBSAFinalBSAConcentrationA700μL100μLofStock250μg/mLB400μL400μLofvialAdiluent125μg/mLC450μL300μLofvialBdiluent50μg/mLD400μL400μLofvialCdiluent25μg/mLE400μL100μLofvialDdiluent5μg/mLF400μL00μg/mL=Blank①各加25μL以上标准品或者样品于96孔板中；②给每孔中加200μLWorkingReagent，充分混匀，震荡30s；③将96孔板在37孵育30min；④冷却至室温；⑤酶标仪读取OD562nm处光吸收值，绘制标准曲线，计算蛋白含量。2SDS-聚丙稀敢胺凝胶电泳(SDS-PAGE)（1）组装制胶架：将玻璃板彻底清洗干净后放于37℃烤箱中烘干，把前后玻璃板对齐后放入卡槽内卡紧，并将玻璃平板及0.75mm垫片组装与制胶架上；（2）配胶：按下表依次加入下列试剂，分别配制12%分离胶和5%浓缩胶；12%分离胶10mL5%浓缩胶3mLH2O3.3mL2.1mL30%丙炼酸胺4.0mL0.5mL1.5mol/LTris（pH=8.8）2.5mL_1.0mol/LTris（pH=6.8）_0.38mL10%SDS0.1mL0.03mL10%过硫酸胺（AP）0.1mL0.03mLTEMED0.006mL0.003mL（3）先注入适量分离胶，上面覆盖去离子水，以阻止空气对凝胶聚合的抑制作用，待分离胶凝固后，弃尽覆盖物，再缓慢注入浓缩胶(避免产生气泡)，插入梳子，等待上层胶凝固；（4）将凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液，使之没过凝胶，垂直拔出梳子；（5）蛋白上样：按每孔60μg蛋白的溶液体积上样，将样品和蛋白Marker依次加入样品孔中，记录号上样顺序；（6）电泳：初始电泳时，电压为80V，待溴酚蓝进入分离胶后，将电压增至130V，电泳至溴酚蓝抵达分离胶底部时终止电泳。3WesternBlotting检测目的蛋白质（1）SDS-PAGE电泳结束后小心取下凝胶，并根据Marker位置，切下目的条带，浸泡于转膜缓冲液中；（2）按照凝胶的大小准备一定规格的PVDF膜，在其左上角做好标记，将其浸泡在甲醇溶液1min，对其激活，再和海绵及滤纸一起浸泡在电转液中提前预冷60min；（3）安装转膜装置：按以下顺序依次组装转膜装置，塑料支架负极、海棉、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海棉和正极支架，注意每放置一层时均要排出气泡。固定于转膜装置后，将塑料支架夹紧放入电泳槽中，将提前预冷的转膜液加入其中，中间放入冰块，进行转膜；（4）接通电源以恒定电压90V，转膜1h；（5）封闭：转膜结束，将PVDF膜取出，放入5%脱脂奶粉封闭液中，室温摇床上封闭2h；（6）一抗孵育：用5%脱脂奶粉封闭液将抗体β-actin按1:500，其它抗体按1:1000稀释，加入50mL离心管内，放入PVDF膜，室温摇床孵育1h后，置入4°C过夜，次日继续摇床孵育1h；（7）一抗孵育结束后，用TBST洗膜3次，每次室温摇床15min；（8）二抗孵育：在自封袋内，用5%封闭液将二抗按1:5000稀释，排空气泡，室温摇床孵育2h；（9）二抗孵育完毕，取出PVDF膜，用TBST洗涤3次，每次室温摇床15分钟；（10）显色：用滤纸将PVDF膜表面多余TBST吸净，将ECL超敏化学发光液A和B等体积混匀后，滴加至PVDF膜上，避光孵育3min，用滤纸吸取剩余的化学发光液，在Bio-Rad凝胶成像仪采集信号并摄取凝胶图像；（11）图像分析：利用ImageLab软件进行蛋白质条带灰度分析，蛋白质相对定量以目的蛋白与内参照蛋白的灰度比值表示。