Westernbloting全攻略

蛋白免疫印迹（Westernblotting或Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。一、基本原理第一部分：SDS-PAGE电泳1、蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的PH值下表现出不同的电荷，为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样缓冲液)。即在样品中加入含有SDS和β-巯基乙醇的上缓冲液。SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3-Na+），是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。电泳样品加入样品处理液后，经过高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷；另外样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程；另外样品处理液中还加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含SDS多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。2、电泳启动时，蛋白样品处于PH6.8的上层，PH8.8的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。出现了PH不连续和胶孔径大小不连续：启动时Cl¯解离度大，Pro¯解离度居中，甘aaCOO¯解离度小，迁移顺序为（PH6.8）Cl¯Pro¯—COO¯。在Cl¯与Pro¯之间和Pro¯与—COO¯之间都将出现低离子区，同时也出现高电势，高电势迫使Pro¯向Cl¯迁移，—COO¯向Pro¯迁移。如：一个Cl¯领路，—COO¯推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。在浓缩胶运动中，由于胶联度小，孔径大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。当蛋白质进入分离胶时，此时Pro¯，Cl¯，甘aa离子在PH8.8的溶液中，Cl¯完全电离而很快到达正极，甘aa电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为缓慢的移动。由于Pro¯在电泳过程中，受到溶液离子的变化而PH值发生变化，但每一瞬间，其所带电荷数除以单位质量是不同的，所以带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。3、PAGE胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶，如下图：催化剂：过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物。4、SDS聚丙烯酰胺凝胶的分离范围丙烯酰胺浓度（％）151210线性分离范围（KD）10～4312～6020～80WesternBlotting实验流程基本操作流程：提取细胞或组织蛋白、测定大致含量；制备SDS-PAGE胶；蛋白样品变性、电泳；电泳转膜；封闭（1小时）；一抗(3小时左右或4度过夜)；TBST洗涤（洗三遍）；HRP标记的二抗（1小时）；TBST洗涤（洗四遍）；ECL试剂作用；X-光片曝光、显影；结果分析；1.主要实验步骤如下：一．蛋白样品的制备贴壁细胞：1、将冷PBS加入组织培养瓶或培养皿中轻轻摇动，直接洗细胞。吸出PBS，重复洗涤，始终将组织培养皿置于冰上。2、在培养瓶中加入适当体积的冰冷裂解缓冲液(含有新鲜配制的蛋白酶抑制剂)，100mm的组织培养皿加约1ml。（或者用胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养瓶移出，再按上述细胞裂解方法制备。）3、在冰上孵育20分钟，然后用橡皮刮从培养皿表面将细胞刮下。4、转移至微量离心管，4度12000转离心10分钟，澄清裂解物。5、将上清液转移至新管，冰上保存，或-20度或-80度冻存悬浮细胞：1、吸取细胞至新圆锥底管子，置冰上。2、4度低速离心细胞，吸弃培养基。3、加10ml冰冷PBS,轻轻翻转管子洗细胞。4、低速离心细胞，吸弃上清。5、重复洗细胞和吸弃上清。以5ml冰冷PBS重悬细胞。6、计数细胞;4度低速离心使细胞沉淀成块，吸弃液体。7、在冰冷的细胞裂解缓冲液（含有新鲜配制的蛋白酶抑制剂）中轻轻悬浮细胞块，107细胞加1ml缓冲液。8、在冰上孵育细胞30分钟。如有必要，在冰上超声处理裂解物15-30S以破坏基因组DNA和细胞组分。9、转移至微量离心管，4度12000转离心10分钟，澄清裂解物。10、将上清液轻轻倒入新管，弃去细胞团块。若即用则冰上保存，或于-20度或-80度冻存至用时。11、凝胶上样前，用BCA,Lowry或Bradford检测法或通过吸光值测量蛋白浓度。组织样本：1、组织样本被解剖后立即在冷PBS中漂洗，并置于冰上的管中。2、对于晓得组织样本（100mg），用干净的解剖器械切成小块。将组织和1-2ml冰冷裂解缓3、4度，12000转高速离心10分钟，以澄清裂解物。4、将上清液轻轻倒入新管，弃去细胞团块。若即用则冰上保存，或于-20度或-80度冻存至用时。5、凝胶上样前，用BCA,Lowry或Bradford检测法或通过吸光值测量蛋白浓度。冲液加入匀浆器，或在小管内超声。在冰上进行匀浆或超声处理。蛋白定量常用蛋白定量试剂盒有BCA蛋白定量试剂盒，commassie改良型蛋白定量试剂盒。4.凝胶的制备