WesternBlot一般实验流程

1WesternBlot实验方法材料、试剂及装置材料：PVDF膜（0.45um）称装转膜转置用于浸泡的圆皿用于结合抗体和洗涤的带分割槽的小皿用于结合一抗的带份割槽的小盒用于显影的小玻璃板试剂：样品特异性一抗β-actin特异性一抗HRP二抗蛋白胶试剂盒预染蛋白marker转膜缓冲液封闭液TBST显影试剂盒（根据二抗的类型选择）装置：Bio-Rad蛋白电泳系统Bio-Rad转膜系统Bio-Rad凝胶成像系统/其他摇床2试剂配置（按照takara实验室常规试剂配置方法表所示）1，10X转膜500mlGlycine（甘氨酸）14.5gTris29gSDS1.85g300mldH2O超声溶解，定容400ml加入100ml甲醇，混匀后4度放置，使用时用含20%甲醇的水溶液稀释10倍使用2，5XTBST500ml100mMTris-HCl（pH8.0）400mlNaCl22gTween201.25ml用100mMTris-HCl（pH8.0）定容500ml，4度保存用时用蒸馏水稀释5倍PS100mMTris-HCl（pH8.0）500mlTris-base（Mw=121.14）6.06g400ml蒸馏水超声溶解，1MHCl调pH8.0定容500ml3，封闭液100mlBD脱脂奶粉5g1xTBST100ml磁力搅拌器加热搅拌（温度不宜过高），溶解后可过滤，以除去不溶性的奶粉颗粒），4度保存3流程1，电泳可参考电泳条件：100mA，50min为节省膜材料，操作时可以仅将目的条带切出而不必整个胶都做转膜a)10%的AP溶液应该现用现配，配置好的AP溶液可以在4度冰箱储存2周左右b)可考虑购买使用较为方便的蛋白胶试剂盒c)可考虑购买预染的marker，以便观察电泳效果并估计目标条带的位置2，转膜—PVDF（0.45um孔径）湿法转膜可参考条件设置：200mA，56min；蛋白大小为40kDa和60kDa左右（实际操作时需要根据目的条带的大小调整电流和转膜时间，转膜时间过短则膜上没有相应的蛋白，转膜时间过长则蛋白迁移出膜）a)PVDF膜剪裁（以适合蛋白胶的情况），切角（以便标记方向），在甲醇中浸泡洗涤以除去表面杂质b)可在电泳期间准备转膜需要的板子、滤纸（三层）、海绵，并将这些材料和膜一同在转膜液中浸泡c)电泳后的胶条在转膜液中浸泡约20mind)转膜装置的组装：在转膜液中按顺序放置材料：黑色面的板（代表负极）—海绵（组装前充分挤压海绵排出气泡）—三层滤纸（注意排出气泡）—蛋白胶（注意胶面的正反及上样的顺序）—PVDF膜（轻轻的压上，注意不产生气泡）—三层滤纸（排出气泡）—海绵（排出气泡）—白色面的板（代表正极），将装置封好，按照黑色对黑色、白色对红色的方式将转膜装置放入转膜的槽中，立即盖上盖子，装置至于冰上开始转膜，转膜时间应严格控制（装置封好后可在转膜液中平衡30min再放入槽中开始转膜）e)可寻找或者购买适合夹取膜的小镊子表1：目的蛋白、胶浓度与转膜时间之间的关系3，封闭封闭液：TBST溶液（TBS+0.01%的tween20）+5%的脱脂奶粉（BD）a)将转膜转置卸下，取出膜，至于小平皿中（可考虑购置专用于western的带分隔槽的塑料平皿，注意考虑膜的大小和宽度），倒入封闭液，以完全浸没膜为准，在摇床上封闭1h（转速大概60rpm，不能太快，也不能过慢）4b)使用后的封闭液可以回收4，洗涤TBST洗涤封闭后的膜a)将封闭液转出，并倒入TBST，以完全浸没膜为准，至于摇床上洗涤，5-6min，重复3次5，一抗孵育使用专用的带分隔的小槽盒（可考虑购买），每个小槽内加入不同类型的一抗（内参（β-actin）以及目的蛋白的特异性一抗）a)以封闭液稀释一抗，按照一抗说明说提供的稀释范围（如果结合效果不好，应该通过更多实验摸索适合当前实验条件的一抗稀释比）在小管等容器中稀释一抗，稀释好的一抗加入小槽（能够浸没小槽底部的最小体积为5ml，可酌情添加）b)将膜至于所需要的、稀释后的一抗中，蛋白面朝上（转膜时与蛋白胶接触的一面为蛋白面），4度过夜孵育（可选择4度过夜孵育、37度1h孵育或者室温2h孵育，但一般建议4度过夜，效果较好，且能够降低一天内的实验强度）6，洗涤TBST洗涤结合了一抗之后的膜，5-10min，洗涤4次（有抗体参与的过程，洗膜时候应该适当延长清洗时间和清洗次数）7，二抗孵育a)使用封闭液按照二抗的说明进行稀释，倒入容器中，室温结合1h（摇床上？）8，洗涤TBST洗涤结合了二抗之后的膜，5-10min，洗涤4次（有抗体参与的过程，洗膜时候应该适当延长清洗时间和清洗次数）9，显影显影前，膜浸泡在TBST溶液中，不能干掉使用试剂盒配置显影液，现用现配a)开仪器，设置显影所需要的程序和参数b)将小玻璃板（洗干净）至于仪器的样品台上c)取出膜，在滤纸上轻轻洗掉多余的液体（膜不能干掉），轻轻放在小玻璃板上（注意不弄出气泡）d)在膜表面滴加配置好的显影液，以完全覆盖住膜为准e)设置显影总时长100s，曝光照片数20，开始显影f)完成后保存protocol，可用于半定量分析（需要设置空白对照，给出的定量值是相对的比值），导出照片，可用于实验记录和发表