WesternBlot实验详细介绍

1WesternBlot实验详细介绍(一)主要试剂的配制1.细胞裂解液：根据目的蛋白所处的位置选择恰当的裂解液：（1）胞浆蛋白很容易提取，裂解液中可以不添加任何去污剂；（2）跨膜蛋白由于膜成分的干扰，就需要添加适当的去污剂，例如选取NP-40裂解液或者RIPA缓冲液；（3）与细胞骨架结合的一些蛋白的提取则需要添加如SDS等强去污剂。（4）核内蛋白的提取可以选择RIPA缓冲液。注：Trizol提取的方法在实践中也常常采用，但是会对蛋白质的质量有一定影响，所以此种方法慎用。2.30%(w/v)聚丙烯酰胺：取290g丙烯酰胺，10gBIS（甲叉双丙烯酰胺），加600ml去离子水，充分搅拌溶解，加去离子水将溶液定容至1L，用0.45μm滤器滤去杂质，于棕色瓶中4℃存放。消化道、呼吸道、皮肤粘膜等多种接触途径，可导致遗传物质损伤和基因突变，具有神经毒性，可致癌。3.10%(w/v)SDS：取10g高纯度的SDS，加80ml去离子水，68℃加热溶解，缓慢加入浓盐酸至PH7.2，加蒸馏水至100mL，室温保存。SDS属于强去污剂。4.1.5mMTris-HCL(pH8.8)：取181.7gTris-base，加800ml去离子水，充分搅拌溶解缓慢加入浓盐酸至PH8.8，让溶液冷却至室温，加蒸馏水至1L，高温高压灭菌后，室温保存。5.0.5mMTris-HCL(pH6.8)：取60.6gTris-base，加800ml去离子水，充分搅拌溶解缓慢加入浓盐酸至PH6.8，让溶液冷却至室温，加蒸馏水至1L，高温高压灭菌后，室温保存。6.10%(w/v)AP（过硫酸铵）：提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。取1g过硫酸铵，加10ml去离子水后充分溶解，4℃避光保存。注：最好临用前配制，4℃保存1周。超过期限会失去催化作用。对皮肤粘膜有刺激性和腐蚀性。27.TEMED（四甲基乙二胺）：催化AP形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。注：TEMED味道很难闻，每次取200μL左右放入一个干净的离心管中，4℃存放。极易挥发，用完一定要盖紧盖子！8.SDS-PAGE加样缓冲液：pH6.8Tris缓冲液、甘油、SDS、巯基乙醇（高毒、杀虫剂原料、易爆品，新鲜配制！）、溴酚蓝混匀备用。9.10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。10.1×转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。提前配制。注：甲醛先不加，先将其他配好的溶液搅拌，在开始转膜时，再讲甲醛加进去搅拌。11.NaN30.02%叠氮钠(有毒，戴手套操作)：溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)，可以防止抗体失活，但会稍影响结合效率，并使HRP失活。12.TBST(洗脱效果好)：配制1LTBST：量取100ml10xTBS+900ml超纯水+1mlTween20。13.脱脂奶粉封闭液：100mlTBST中加入5g脱脂奶粉，搅拌均匀。（二）蛋白样品制备1、单层贴壁细胞总蛋白的提取：倒掉培养液→预冷的PBS洗涤细胞→弃去洗液→加裂解液（PMSF100mM/PI1:100），吹匀置于冰上。→冰上裂解30min（不要超过1h），为使细胞充分裂解要经常弹细胞。→于4℃下12000rpm离心10min。→离心后的上清取1ul测浓度，其余加loading煮样后分装放于-20℃保存（1周），-80℃（1月-1年）。注：细胞破碎多采用物理方法，如反复冻融法、冷热交替法、超声波法等。2、组织中总蛋白的提取：用干净的剪刀将组织块尽量剪碎,将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位匀浆使组织破碎。然后按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。)裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml3离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中。注：组织的破碎多采用机械破碎法，如电动捣碎机或匀浆机。使用匀浆机时要注意机器功率的选择，太大也会破坏组织。特别注意的是：①实验期间将蛋白样本保存于冰上；②每份样本吸取均使用新的、一次性吸头；③操作中配戴手套以防止其他蛋白以及蛋白酶的污染；④不要剧烈震荡或过度用力吸取，以减小蛋白变性可能性。（三）蛋白含量的测定蛋白定量的方法很多，如紫外光吸收法、双缩脲法、Bradford、BCA、Lorry法等。其基本原理为用已知浓度的蛋白作标准曲线，然后测目的蛋白的光吸收值，从曲线上查出对应浓度。以上方法各有优缺点，实验室比较常用的为BCA法，具体测定步骤参见试剂盒说明书。注：先做预实验确定所测蛋白浓度是否在标曲范围内，如果不在，还需要稀释蛋白后再测浓度。（四）蛋白质样品的保存1、蛋白必须低温保存，同时添加相应稳定剂，以保持蛋白的生物活性。2、由于冷变性作用，对于甘油（50%，v/v）或硫酸铵（3.2M）蛋白悬浮溶液来说，应该避免冻存。3、避免酶溶液的反复冻融。如果要冻存酶溶液，将酶溶液分装为小份。4、蛋白冻存要迅速，并保存于液氮环境中。长期保存要于蛋白溶液中添加10-20%的甘油。注：高度稀释的蛋白质溶液通常不稳定。如果无法进行快速浓缩，可添加其他蛋白质（例如：BSA，最大约1%。此外，低分子量物质如甘油或蔗糖可帮助稳定蛋白。特定盐离子（阳离子与阴离子）可显著稳定溶液中的蛋白，广泛使用的稳定剂硫酸铵含有最有效的两种离子：NH4+与SO42-。通过添加还原剂，如β-巯基乙醇（终浓度为5-20mM）或二硫苏糖醇（0.5–1mM），可防止半胱氨酸巯基基团的破坏性氧化反应。4（五）WesternBlot操作流程准备工作：（1）清洗玻璃板：手扣紧玻璃板，洗洁精冲干净，制胶面不挂水，晾干/烘干(注：洁净程度应同细胞用品泡酸后的洁净程度，用眼睛看不到杂质）（2）清洗夹子、架子、胶条、电泳槽、梳齿（3）安装并检漏（注：玻璃板对齐，左右同时夹紧，玻板位于胶条中央。装好后要检查是否漏水。）（4）PAGE胶配制：先配分离胶，分离胶凝固后再配浓缩胶。配方具体参见说明书。（注：加入TEMED后快速摇匀后灌胶，动作轻缓，避免产生气泡。TEMED和30%AP的用量决定其凝胶速度，因此要根据实际条件适量添加。）（5）灌胶：夹紧电泳板块，按浓度灌胶，分离胶在下层，浓缩胶在上层；分离胶灌完后用水液封，使其表面平整，凝胶时间20-30min。然后倒水，灌入浓缩胶，立即保持水平/从一边到另一边插入上样梳子。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔上样体积减小，所以在胶凝固的过程中在两边边不断补加浓缩胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。（注：45度缓慢加水液封，不要过急，以免胶面不平整。要控制胶面高度、配胶时摇动不要过剧、避免产生气泡，掌握合适凝胶时间。由于季节、区域不同，凝胶条件要适时摸索。）（6）制好的胶连同玻板放入电泳槽中。（注：检查玻板方向、排出底部气泡、防漏液）1、上样样品准备每次上样前要将已调整到一致浓度的样品于200μl的EP管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×，于pcr仪中，99℃，变性10min。对于多次跨膜蛋白，可以于70°C变性5-10分钟。（注：变性后要10000rpm/min，离心1min。采用煮沸的方式变性，规范的操作顺序是煮沸→离心→震荡→再离心。）2、点样每孔上样量为20-40μg蛋白，使用专用枪头或注射针头，勿溢出加样孔。（注：不要吸进气泡、不要上样太快冲出样品、避免交叉污染、补加平衡液。）53、电泳采用不连续凝胶电泳分离蛋白，上层采用低浓度凝胶（浓缩胶）压紧蛋白样品，下层的较大浓度凝胶（分离胶，主体）分离目的蛋白。浓缩胶用80V,跑完浓缩胶换110V，40mA跑分离胶，电泳时间为70mim。（注：电泳过程中要保持电压的稳定，确保跑出来的条带平整。）4、切胶转膜A、转膜前要按照一定的规格将PVDF膜剪裁并在右上角标记好放入甲醇中预处理，转膜液要预冷。滤纸、海绵、夹子、玻棒浸泡于转膜液中。B、将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡，在海绵上垫三层滤纸。C、从两边轻轻撬动揭开上层玻板，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破，根据目的条带切胶，小心剥下切好的分离胶于滤纸上，调整使其与滤纸对齐，可用缓冲液轻轻赶走气泡。然后将PVDF膜盖于切好的胶面上，在PVDF膜上盖三张滤纸并除去气泡，最后盖上海绵垫，夹紧夹子。（注：整个过程要在转移液中进行，要不断除去气泡，膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。顺序：黑板→海绵→滤纸→胶→PVDF膜→滤纸→海绵→透明板）D、将夹子转移入槽中，要使夹子的黑板对槽的黑面，夹子的透明板面对槽的红面。110V，180mA，70min。转膜时电极方向是膜正胶负。（注：一定是在冰浴中电转膜，因为电转过程会产热。）E、转膜后用镊子小心将膜反转过来至于干净的平皿中，根据目的条带剪膜并在右上角剪一个角标记。5、TBST洗膜：将膜放于干净的平皿中，用TBST在摇床上洗5次，每次3min.6、膜的封闭将洗过的膜转入含有5%脱脂奶粉封闭液的平皿中，封闭90min-2h，摇床转速不要太快。（注：封闭液选择考虑与检测试剂相适应、封闭充分，背景尽量浅。防止非特异性吸附，封闭一定要充分，分子量标准位置进行标记，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。）封闭结束后，用TBST洗膜，摇床上洗6次，每次5min。7、抗体杂交6(1)一抗孵育：根据说明书按照适当比例使用TBST稀释一抗，然后将膜转移到含有一抗的管中，4℃孵育过夜或室温（22-25℃）摇动孵育2h。（注：一抗可回收，2-3天内使用，但仅限于是在4℃孵育过夜的，如果是在室温下的，一抗则不能重复利用。抗体用量计算：0.1ml/cm2）一抗孵育结束后，用TBST在摇床上洗6次，每次5min，去除残留一抗。(2)二抗孵育：按照适当比例使用TBST稀释标记HRP的二抗（1：5000），室温孵育1h。二抗孵育结束后，用TBST在摇床上洗6次，每次5min。注：a、单抗专一性高，多抗不如单抗专一性高但更容易得到结果；b、如果不存在高背景的问题，某些抗体用含低浓度(0.5–0.25%)脱脂奶粉或BSA的封闭液来稀释，可产生相对更强的信号条带；c、抗体少还要摸条件(稀释度)，可以用剪膜剩下的边角料来先做几组点杂交摸条件，省点时间省点试剂；d、转膜前胶要在转移缓冲液里平衡一下防止胶变形，也有助于进一步去掉可能有碍转膜的杂质。也可在这一步浸泡帮助蛋白复性，可以直接在胶上检测蛋白活性。8、曝光检测发光液配制：现用现配，1ml=900ulH2O+50ul显色剂A+50ulB，A:B=1：1。发光—显影：（1）准备好手套、镊子，擦桌、压片夹，确认暗房试剂、工具、X光片。（2）铺上保险膜，将洗完二抗的PVDF膜吸水纸控干，正面向上，快速均匀涂上发光液，1min（5min内）。（3）用纸巾吸去多余的发光液,用保鲜膜封好膜，正面向上置于压片夹内。（4）戴上手套，迅速进暗室中，打开红灯，剪合适大小X光片使胶片暴光1-5分钟，暴光时间几秒~长到数小时。冲洗胶片：先在显影液中冲洗至胶片上出现条带，再放入水中漂洗，最好定影液中漂洗至胶片透明。若取出后发现没有定影好可重新置定影液中定影至完全透明。自来水冲洗（不能用手摸）、晾干。曝光要快。9、凝胶图像分析：将胶片进行扫描拍照，用凝胶图像处理系统分析目的条带的分子量和净光密度，分析表达差异。