应医学院10医检专微生物检验3

2019/8/131第三章细菌感染的病原学诊断褚云卓2019/8/132本章内容第一节标本的采集和处理原则第二节细菌的形态学检查第三节细菌的分离培养和鉴定第四节细菌的非培养检测方法2019/8/133第一节标本的采集和处理原则一、标本采集的一般原则1．早期采集2．无菌采集3．根据目的菌的特性用不同的方法采集4．采集适量标本5．安全采集2019/8/134第一节标本的采集和处理原则二、标本的处理1.对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌等应保温并立即送检2.其他所有的标本采集后最好在2h之内送到实验室3.若不能及时送检，标本应置于一定环境中保存4.一般情况下，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h2019/8/135５.病人标本中可能含有大量致病菌，必须注意安全防护６.标本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必须包装好，防止送检过程中倒翻或碰破流出７.对于烈性传染病标本运送时更要特别严格，必须按规定包装，由专人运送８.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送2019/8/136第二节细菌的形态学检查1.包括不染色标本检查法和染色标本检查法2.镜检可以了解有无细菌及大致的菌量3.根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类4.通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义2019/8/137第二节细菌的形态学检查一、不染色标本1.细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况2.常用的方法有压滴法和悬滴法有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显的方向性位移无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变2019/8/138第二节细菌的形态学检查3.有些病原菌通过不染色标本的动力检查可作出初步鉴定如疑似霍乱患者，镜下观察到来回穿梭似流星状运动的细菌，制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。2019/8/139第二节细菌的形态学检查二、染色标本（一）常用染料1．碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等2．酸性染料：有伊红、刚果红等3．复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料有瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料有荧光标记的抗体2019/8/1310第二节细菌的形态学检查（二）常用的染色方法1．革兰染色（gramstain）革兰阳性球菌革兰阴性杆菌2019/8/1311第二节细菌的形态学检查2．抗酸染色（acid-faststain）可将细菌分为两大类：即-抗酸性细菌-非抗酸性细菌2019/8/1312第二节细菌的形态学检查3．荧光染色（1）荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。（2）主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。2019/8/1313第二节细菌的形态学检查4.鞭毛染色可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。5.异染颗粒染色用于白喉棒状杆菌染色。2019/8/1314第二节细菌的形态学检查6.芽胞染色：绿色部分为芽胞2019/8/1315第二节细菌的形态学检查7.墨汁染色:一般用于新型隐球菌检查2019/8/1316第三节细菌的分离培养和鉴定一、培养基的种类和选择培养基的组成成分、培养基种类、培养基的选择二、分离及培养细菌的分离、细菌培养方法三、生化反应和鉴定碳水化合物的代谢试验蛋白质和氨基酸的代谢试验碳源和氮源利用试验2019/8/1317第三节细菌的分离培养和鉴定一、培养基的种类和选择培养基（culturemedium）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。2019/8/1318第三节细菌的分离培养和鉴定(一)培养基的组成成分1．营养物质蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子2．凝固物质琼脂、明胶、卵白3．抑制剂和指示剂2019/8/1319第三节细菌的分离培养和鉴定（二）培养基种类1．基础培养基（basedmedium）2．营养培养基（nutrientmedium）3．鉴别培养基（diferentialmedium）4．选择培养基（selectivemedium）5．特殊培养基（specialmedium）2019/8/1320第三节细菌的分离培养和鉴定1．基础培养基含有基础生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，俗称肉汤（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。2019/8/1321第三节细菌的分离培养和鉴定2．营养培养基（nutrientmedium）最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板等2019/8/1322第三节细菌的分离培养和鉴定3．鉴别培养基（diferentialmedium）糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）、伊红-镁蓝琼脂和动力-吲哚-尿素（MIU）培养基等。2019/8/1323第三节细菌的分离培养和鉴定4．选择培（selectivemedium）SS琼脂使致病的沙门菌、志贺菌容易分离到2019/8/1324第三节细菌的分离培养和鉴定5．特殊培养基（specialmedium）疱肉培养基、巯基乙醇酸纳培养基2019/8/1325第三节细菌的分离培养和鉴定（三）培养基的选择根据标本来源和可能存在的病原菌，确定选用各种分离培养基。伊红美蓝/麦康凯用于筛选革兰阴性杆菌。2019/8/1326第三节细菌的分离培养和鉴定（三）培养基的选择从血液、骨髓中分离病原菌用血液增菌培养基2019/8/1327第三节细菌的分离培养和鉴定1．平板划线分离法2．斜面接种法3．液体接种法二、分离及培养（一）细菌的分离4．穿刺接种法5．倾注平板法6．涂布接种法2019/8/1328第三节细菌的分离培养和鉴定（二）细菌培养方法1．需氧培养法2．二氧化碳培养法3．厌氧培养法2019/8/1329第三节细菌的分离培养和鉴定三、生化反应和鉴定（一）碳水化合物的代谢试验1.糖（醇、苷）类发酵试验是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要2019/8/1330第三节细菌的分离培养和鉴定2．氧化―发酵试验（O/F试验）主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。2019/8/1331第三节细菌的分离培养和鉴定3．β―半乳糖苷酶试验（ONPG试验）迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。2019/8/1332第三节细菌的分离培养和鉴定4．七叶苷水解试验主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。5．甲基红试验主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌。6．V―P试验本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。2019/8/1333第三节细菌的分离培养和鉴定2．吲哚(靛基质)试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验1．明胶液化试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。2019/8/1334第三节细菌的分离培养和鉴定3．硫化氢试验培养基：醋酸铅培养基应用：主要用于肠杆菌科中属及种鉴别2019/8/1335第三节细菌的分离培养和鉴定4．尿素分解试验主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。5．苯丙氨酸脱氨酶试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗菲登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。6．氨基酸脱羧酶试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。2019/8/1336第三节细菌的分离培养和鉴定（三）碳源和氮源利用试验1．枸橼酸盐利用试验用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。2．丙二酸盐利用试验肠杆菌科中属间及种的鉴别。2019/8/1337第三节细菌的分离培养和鉴定（四）各种酶类试验1．氧化酶试验主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。2．过氧化氢酶试验（触酶试验）用于革兰阳性球菌的初步分群。2019/8/1338第三节细菌的分离培养和鉴定3．硝酸盐还原试验本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。2019/8/1339第三节细菌的分离培养和鉴定4．脂酶试验主要用于厌氧菌的鉴别。5．卵磷脂酶试验主要用于厌氧菌的鉴定。6．DNA酶试验在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷氏菌和变形杆菌产生此酶。2019/8/1340第三节细菌的分离培养和鉴定8．CAMP试验在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定。7．凝固酶试验作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。2019/8/1341第三节细菌的分离培养和鉴定（五）抑菌试验1．O/129抑菌试验用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对O/129敏感，而气单胞菌属耐药。2．杆菌肽试验用于A群链球菌与非A群链球群的鉴别。3．奥普托欣（Optochin）试验主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。2019/8/1342第四节细菌的非培养检测方法一、免疫学检测抗原检测、抗体检测二、分子生物学检测核酸杂交、聚合酶链反应、生物芯片技术三、细菌毒素的检测内毒素、外毒素四、动物实验2019/8/1343第四节细菌的非培养检测方法一、免疫学检测（一）抗原检测免疫荧光技术是利用免疫学特异性反应与荧光示踪技术相结合的显微镜检查手段。既保持了血清学的高特异性，又极大地提高了检测的敏感性，在细菌鉴定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、间接法和免疫荧光菌球法。2019/8/1344第四节细菌的非培养检测方法一、免疫学检测（二）抗体检测抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价的升高。因此用已知的细菌或其特异性抗原检测病人血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。主要适用于抗原性较强的致病菌和病程较长的感染性疾病。2019/8/1345第四节细菌的非培养检测方法二、分子生物学检测（一）核酸杂交DNA可进行变性、复性、杂交。我们利用这一特性，制备特定序列DNA片段，进行标记后用作探针，在一定条件下，按照碱基互补配对原则与标本中已变性的细菌DNA进行杂交，通过检测杂交信号确定是否发生杂交反应，从而鉴定标本中有无相应的病原菌基因。2019/8/1346第四节细菌的非培养检测方法二、分子生物学检测（一）核酸杂交1.探针的种类（1）全染色体DNA探针（2）染色体克隆片段DNA探针（3）质粒DNA探针（4）rRNA基因探针（5）寡核苷酸探针2019/8/1347第四节细菌的非培养检测方法2．核酸杂交在临床细菌检测中的应用（1）细菌分类鉴定（2）细菌快速鉴定（3）细菌耐药性的检测（4）细菌毒素的检测（5）细菌流行病学调查2019/8/1348第四节细菌的非培养检测方法（二）聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）1.特异性DNA体外扩增技术2.特异、灵敏、快速、操作简便3.广泛应用于细菌的鉴定2019/8/1349第四节细菌的非培养检测方法PCR在临床细菌检测中的应用1.细菌的快速检测2.细菌毒素的检测3.细菌耐药性的检测4.细菌流行病学调查2019/8/1350第四节细菌的非培养检测方法（三）生物芯片技术1.通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统。2.对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。3.常用的生物芯片分为二大类：即基因芯片和蛋白芯片。2019/8/1351第四节细菌的非培养检测方法三、细菌毒素的检测（一）内毒素内毒素的测定，主要用于确诊病人是否发生革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。方法：鲎试验。2019/8/1352第四节细菌的非培养检测方法（二）外毒素外毒素的测定可用于待检菌的鉴定，同时可区分产毒株与非产毒株。方法：1.体内毒力试验2.体外毒力试验2019/8/1353第四节细菌的非培养检测方法四、动物实验1.用途：