Fish技术及其在植物研究中的应用

Fish技术及其在植物研究中的应用许家辉农学13-120136559摘要：FISH(fluorescenceinsituhybridization)技术：荧光标记的原位杂交技术。Fish是20世纪生物学领域的一项新技术。FISH应用细胞遗传学和分子生物学的基本原理，作为架设细胞遗传学与分子生物学之间的桥梁，现已被广泛应用于植物学各方面的研究。本文就FISH的基本原理、技术发展及其在植物遗传育种、起源进化、染色体物理图谱构建面的应用及发展趋势进行了综述。关键词：荧光原位杂交、植物研究、发展趋势1、原理和操作程序荧光原位杂交(FISH)技术的基本原理是根据DNA→DNA和DNA→RNA碱基的配对原则与染色体上相对应的序列杂交，将DNA探针用生物素等荧光染料标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异结合，通过荧光杂交信号来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定性、定位分析。其基本操作程序可概括为：染色体制片→探针的种类选择和标记→探针与靶序列的变性和杂交→杂交后的洗脱→杂交信号的放大、检测和观察。1.1染色体制片原位杂交的效率取决于探针与染色体的靠近程度，因此必须获得大量背景清晰、染色体分散且形态较好的中期分裂相；传统方法是取植物幼嫩根尖有丝分裂中期染色体作为制片材料，但有些植物尤其是木本植物很难取得大量分裂旺盛的根尖，因此，为了拓宽材料来源，只要是植物分生组织如幼嫩茎尖、愈伤组织、幼小花蕾等都可成为获取分裂相的研究材料。1.2探针的种类与标方法1.2.1探针的种类探针可以分为基因组探针、染色体特异重复顺序探针、染色体文库探针、单一顺序探针、RNA探针等，FISH分析所用探针还包括较长的基因组克隆，如BAC、YAC以及现有的RFLP标记等。探针的获得可通过克隆、酶扩增及化学方法合成。1.2.2标记方法探针标记有直接标记和间接标记两种方法：(1)直接标记是将荧光分子直接标记于探针DNA或RNA上，杂交后可直接在荧光显微镜下检测。荧光素可以直接标记核酸探针，杂交体用荧光显微镜观察，在不同激发光照射下可发出不同颜色的荧光。这种方法快速简洁、结果背景干扰很少，但杂交信号较弱，且不能进一步放大；(2)间接标记是采用一中间分子标记探针，杂交后再用荧光分子标记的中间分子的亲和物或抗体进行检测。荧光标记探针的应用使在同一细胞制片上同时进行不同基因的定位成为可能，也就是从原先的原位杂交发展到多重原位杂交，在多重原位杂交的基础上又发展出多色原位杂交，常通称为M—FISH。1.3探与靶序列的变性和杂交杂交前，双链的探针和靶DNA必须变性为单链的DNA，常用加热或碱变性法行变性。对于单拷贝基因的杂交，特别是较长的来自基因组的序列，一般在杂交之前应进行预复性过程，使探针中非特异的重复序列被封闭，从而抑制该部分探针与染色体之间发生非特异性杂交。经预复性之后的探针与变性的染色体标本杂交过夜。同时，对靶序列进行各种预处理如用蛋白酶进行消化去除蛋白，常能增加结果的信号强度。1.4杂交后的洗脱杂交结束后，标本经清洗，以去除非特异杂交或未发生杂交的探针，目前常采用梯度洗脱方法。1.5杂交信号的检测和观察检测方法包括直接荧光法和间接免疫荧光法。如用荧光染料直接标记探针，可用直接荧光法进行检测(一般采用荧光标记的卵白素检测)；若用半抗原标记探针，则可通过间接免疫荧光法即荧光标记的相应抗体进行检测。2、FISH在植物学研究方面的应用FISH运用细胞遗传学和分子生物学的原理，作为细胞生物学与分子生物学之间的桥梁，现在被广泛应用于植物遗传育种、起源进化、染色体物理图谱构建等方面的研究，并已取得了很好的实验结果。2.1FISH在植物遗传研究上的应用荧光原位杂交技术直接从DNA水平上检测染色体的构成和变化情况，可以准确地显现异源染色体或其片段存在于染色体(组)中的部位，对染色体或染色体片段的遗传变化分析起着重要的作用。Mansfield等应用FISH技术能特异地从原位检测到miRNA的表达；JanPostberg通过3-DFISH实验研究，发现rRNA基因主要集中在毗邻纤丝或含有NoplP的微体处，而不是包含在它们的内部；杨昆等利用SRK和SCR2种探针同时在甘蓝粗线期染色体和EDFs(DN伸展纤维)上进行了原位杂交，首次鉴定了s基因座在其单倍体基因组中具有单拷贝性；魏文辉等从甘蓝型油菜基因组DNA中分离出Cot-1DNA，将其用生物素标记后作为探针，对甘蓝型油菜染色体进行原位杂交，发现在每对染色体上均显示出特定的荧光原位杂交带，每对染色体有特定的带型，并首次构建了甘蓝型油菜的核型。目前，利用荧光原位杂交成功地鉴定出小麦背景下大麦、黑麦、偃麦草披碱草、大赖草的染色体或其片段。2.2FISH在植物育种上的应用FISH在植物育种上被广泛用来进行目标基因序列的定位分析。野生植物常具有一些如抗病性、抗旱性等良好的抗逆性状，而这些性状通常由抗性基因所控制。因此，在育种上将野生种和栽培种进行杂交或结合转基因技术，将目标基因转入欲改良的植株中，以期获得具优良性状的杂种后代。运FISH的方法对杂种后代进行鉴定，可判定植物育种后代是否带有外源DNA片段，从而在细胞分子水平上证实杂交或转基因是否成功。中国科学院遗传研究所利用荧光原位杂交方法首次将紧穗野生稻的抗褐飞虱新基因在易位系中定位于第2染色体的RM240和RM250之间，并将它成功地导入栽培稻中，创制了一批抗褐飞虱且农艺性状优良的中间材料，探索出一条将野生稻优良基因导入栽培稻的有效途径；葛荣朝等利用荧光原位杂交和微卫星标记技术对小麦一多枝赖草二体异附加系Line15进行耐盐性验证，证实小麦一多枝赖草杂交后代Line15为一个具有较高耐盐特性的材料，为植物抗性育种奠定了基础；英加等应用FISH技术对普通小麦和长穗偃麦草的杂交后代的2个蓝粒易位系(9902、9906)进行研究，发现9906中被易位蓝粒片段的相对长度约占易位小麦染色体短臂的1／3，而9902中被易位蓝粒片段的相对长度约占易位小麦染色体长臂的1／2，并将9902的蓝粒易位片段定位在小麦D组染色体上，为进一步克隆蓝粒基因提供了重要材料。2.3FISH在植物起源进化研究上的应用利用荧光原位杂交技术通过对特定DNA序列特别是编码序列在染色体上分布位置的研究，对探讨基因组起源、进化具有重要的理论意义。荧光原位杂交在植物染色体上成功地对多基因家族进行作图，通过FISH技术对基因在染色体上分布的位置、位点以及拷贝数多少进行比较研究，可以确定近缘物种的亲缘进化关系及起源。周树军应用基因组荧光原位杂交区分百合杂交后代中不同亲本的基因组并检测不同基因组染色体交换，同时运用重复序列荧光原位杂交区分不同六出花的基因组和筛选染色体标记。荧光原位杂交技术不仅可以准确识别易位染色体，而且可以确定易位的断点，对揭示物种的形成、演化过程中供体基因组如何变化有重要作用。在自然状态下，seria和Aloe两属间几乎没有杂种，栽培条件下，可通过胚培养获得少量属间F代，但这些杂种是高度不育的。有一个属间杂种G．1utzii×A．aristata不仅是个野生的杂种二倍体，而且是可育的，减数分裂仍可进行。通过FISH研究发现这2个亲本种的基因组还是有较大分化的，但在F。杂种中，来源于各自供体种的4条大染色体两两配对，尽管它们在形态上存在差异，再对回交子代的体细胞进行原位杂交，发现有明显的易位现象，证实了F减数分裂中异形的配对染色体在分离过程中发生了片段的易位，产生了一套双亲染色体片段的配子。2.4FISH在植物染色体物理图谱构建上的应用物理图(physicalmap)是采用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或者克隆标定在基因组实际位置的图谱，对了解基因间的真实连锁关系和认识和改造染色体结构，研究基因结构和功能关系及基因工程育种，检查遗传图中基因次序与臂区划分的准确性都具有很重要的意义，因而被广泛地用于DNA物理图谱的构建例。王晶等一应用GISH技术对小麦与高冰草不对称体细胞杂种Fj代株系Ⅱ一卜3和I一1—9的染色体组成及异源染色体存在方式进行分析，结果表明高冰草染色体以小片段的方式分布在杂种Ⅱ-1-3和1-1-9的4～6个染色体上，小片段位于小麦的近着丝粒位置及近端部；Stephens等采用高灵敏度的TSA—FISH技术直接对大麦的RFLP进行了物理作图，显示了这种技术作为大基因组FISH物理作图的发展趋势。3、发展趋势及展望随着显微技术的不断改进、探针设计的日益更新以及对实验对象的纤丝化处理，FISH技术在植物研究中应用的广度和深度上不断扩大和深入。2O世纪9O年代出现的DNA纤维FISH，除了显著提高FISH空间分辨率外，也使FISH灵敏度进一步提高，荧光原位杂交方法逐步形成了从单色向多色、从中期染色体FISH向粗线期染色体FISH再向纤维FISH发展的趋势，灵敏度和分辨率正在由Mb向kb、百分距离向碱基对、多拷贝向单拷贝、大片段向小片段再向BAc／YAC等方向深入FISH的进一步发展，还将开发出稳定有效的方法，以定位更短的基因片段，可以方便地定位来自cDNA的基因，从而大大加快物理图谱与基因图谱的绘制，如光学作图和纤维FISH数字作图。原位延伸FISH技术，可能是有希望的方法。另外，多肽核酸FISH和锁链探针FISH是较新的FISH技术，它们在FISH的定量和特异性方面将大有可为。参考文献：谭瑞，魏文辉.《生物化学与生物物理进展》，2000.陶春丽，郭文武.华中农业大学报，2002.王丽，李云飞。植物分类学报，2004.韩方普，卜秀玲.植物学报，1998.陈芳，殷勤伟.科学通报，2005.杨昆，朱利泉.遗传学报，2006.魏文辉，赵万鹏，王力军.植物学报，2005.