FISH试剂盒说明书翻译

FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。FISH(fluorescenceinsituhybridization)荧光标记的原位杂交技术P2试剂和说明提供的材料一盒包含4种试剂，可做20次试验，一次检测22mm×22mm靶区。X/YDNA探针盒：X/YDNA探针（已提前变性）：﹣20℃避光保存DAPIⅡ复染剂：﹣20℃避光保存NP-40：﹣25~﹣30℃22×SSC：﹣20℃~﹣25℃储存和处理未开封X/YDNA试剂盒﹣20℃避光干燥处保存。20×SSC盐和NP-40可以单独储存于室温。阳性对照片应在-20℃条件下，密封加干燥剂保存。需要但公司不提供的材料实验室试剂超纯甲酰胺100%乙醇，室温储存浓缩的（12N）盐酸1N氢氧化钠纯净水（蒸馏水或去离子水或Milli-Q），室温储存固定剂（3:1甲醇：乙酸）每日新鲜配置Drierite(商品名，干燥用无水硫酸)和液氮P3实验室设备荧光显微镜设备和推荐的滤光片相差光学显微镜预清洁的显微镜玻片载玻片加热器（45℃-50℃）22mm×22mm玻璃盖玻片可调容积吸管（1-10ul）和无菌微量移液管头聚丙烯微量离心管（0.5ml或1.5ml）计时器磁力搅拌器漩涡混合器微量离心机刻度量筒水浴锅（67±2℃和73±1℃）有氧培养箱（42℃）钻石笔湿盒镊子一次性注射器（5ml）染色缸（6）建议型号：WheatonProduct.No.900620竖式染色缸pH剂和pH试纸温度计金属丝试管架橡胶胶水0.45um细孔过滤设备工作液的准备20×SSC66g20×SSC200ml纯化水250ml最终量彻底混合，用pH计室温下测pH。如果需要，用浓盐酸调pH到5.3。加纯水至总量250ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。室温储存6个月。变性液49ml甲酰胺7ml20×SSCpH5.314ml纯化水70ml最终量充分混合，放置于玻璃染缸。用pH计室温下测pH。确保pH在7.0-8.0。储存于有盖容器2-8℃。可最多使用1周。每次用前测定pH。乙醇洗液用100%乙醇和纯化水v/v稀释70%，85%。盖紧容器盖子室温下储存。若未发生蒸发或因过量使用所致溶液稀释，可使用1周。0.4×SSC洗液950ml纯化水20ml20×SSCpH5.31000ml最终量彻底混合。用pH计室温下测pH，用1N氢氧化钠调pH至7.0-7.5。加纯水至总量1000ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。未使用过的液体室温储存6个月。使用过的液体当日丢弃。0.1%NP-40在2×SSC中100ml20×SSCpH5.3849ml纯化水1mlNP-401000ml最终量彻底混合，用pH计室温下测pH，用1N氢氧化钠调pH至7.0-7.5.加纯水至总量1000ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。加入70ml至染缸中保持室温。未使用的液体于加盖容器中室温储存6个月。使用过的液体当日丢弃。P4标本收集、处理、储存和玻片准备标本收集和处理FISH测试步骤标本DNA变性：1.在准备玻片前将杂交湿盒（一个密闭容器）置于42℃培养箱预热至42℃。2.加入变性液至玻片染色缸并于73±1℃水浴至少30min。使用前测量温度。3.标本DNA变性：将准备好的玻片浸泡在73±1℃变性液中5min。每一个玻片染色缸一次不要放入超过4张玻片。4.用镊子将玻片从变性液中移出并立即置于室温下70%酒精洗液。摇动玻片除去甲酰胺。让玻片立于酒精洗液中1min。5.从70%酒精中移出玻片，依次用85%、100%酒精重复步骤4。6.晾干多余的酒精：用吸墨纸触及玻片底边并用实验室擦拭纸擦拭玻片下面。P57.在滴加探针溶液前，将玻片置于45-50℃载玻片加热器上不超过2min。注意：如果在探针准备好之前玻片已备好超过2min，玻片应保留在100%酒精广口瓶内。在将玻片置于玻片加热器前不要风干。探针准备1.将探针在室温复温，以降低其粘度便于准确吸取。2.涡流混合。在微量离心机轻微离心1-3s，使内容物沉于试管底部。再次轻轻涡流混合。注意：探针是提前变性的，在标本玻片上滴于靶区。杂交1.将10ul探针溶液滴于玻片的靶区。立即将22mm×22mm盖玻片覆盖于探针溶液上使溶液在盖玻片下均匀扩散。气泡会干扰杂交，应避免。注意：在盖上盖玻片前勿将探针溶液滴在多个靶区。2.将玻片置于提前预热至42℃的杂交湿盒中，盖紧湿盒的盖子。3.将杂交湿盒放于42℃培养箱，杂交过程至少30min。注意：在一些标本中，为获取更强的信号，也许需要更长的杂交时间。可能过夜培养（长达16小时）。超过1小时的培养，盖玻片必须用橡胶胶水一类的可清除密封剂密封，杂交湿盒必须加湿。过程如下。用5ml注射器抽橡胶胶水。在盖玻片和玻片周围涂少量橡胶胶水，从而形成密封圈。将玻片置于加湿的杂交湿盒中（一个密闭容器,内置一片浸湿的吸墨纸或在容器内侧贴1in.×3in.纸巾）。用密闭门关盖湿盒，培养1-16小时。培养后，从玻片上除去橡胶胶水。杂交后洗涤1.加入0.4×SSC（pH7.0-7.5）至玻片染色缸中。将玻片染色缸放于73±1℃水浴中至少30min或者直至溶液温度达到73±1℃，以预热0.4×SSC溶液。注意：如果一次杂交的玻片数量超过4片，必须分批次洗涤。每次洗涤前洗液温度必须回至73±1℃。2.从第一张玻片的靶区移去盖玻片并立即将玻片置于含0.4×SSC玻片染色缸中。摇动玻片1-3秒。重复操作剩下3张玻片，73±1℃温育2min。注意：在新加入玻片前不要移去盖玻片？在最后一张玻片加入水浴后开始计时2min。3.从水浴中拿出所有玻片放于室温2×SSC/0.1%NP-40缸中50-60s。玻片放置于水浴后摇动1-3s。4.在暗处风干玻片（密闭抽屉或含架子的密闭橱柜）。5.用10ul的DAPIⅡ复染液滴于玻片靶区，覆盖盖玻片。在信号计数前将玻片储存于暗处。储存在﹣20℃的暗处储存杂交玻片（含盖玻片）。在此条件下玻片可以储存12个月而没有荧光信号强度的显著丢失。若要延长储存时间，需将盖玻片密封以防干燥同时﹣20℃储存。信号计数评估玻片用以下标准评估：探针信号强度：信号应明亮，清晰，可计。信号应为明亮紧凑的椭圆形或线性弥散的椭圆形。背景：黑暗，无荧光颗粒，无朦胧。交叉杂交/目标特异性：探针应只在目标上杂交和显影（X染色体着丝点或Y染色体的Yq12）需评估中期分裂相以发现交叉杂交和非目标序列。至少有98%的细胞应表现1个或更多信号。（参看以下信号计数指南）问题解决指南，处理新鲜玻片。选择最佳视野和可计数的细胞核用25×物镜扫视杂交区域，观察标本分布。挑选标本分布稀疏，无间期与中期分裂相重叠处，视野内可见间期或中期分裂相。避免细胞密集，重叠，或单个核的核边界不清。避免丛密细胞区。只计数信号清晰的细胞。计数用40×或63×物镜，选定视野的左上区，从左至右，计数每个可计数中期分裂相细胞（计数＞20个）的信号数或每个可计数间期细胞核（计数＞500个）边界内的信号数。计数200个间期细胞核后若有5%以上无杂交信号则杂交失败。