ELISA的基本原理

ELISA的基本原理[1]ELISA是指以酶作为标记物、以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。因此，一个ELISA测定试剂，其有机组成部分包括：（1）包被的抗原或抗体的固相支持物，即聚苯乙烯塑料微孔或试管；（2）酶标记的抗体或抗原和（3）酶的反应底物等。抗原或抗体的固相化，并不影响其免疫结合活性，酶标记的抗体或抗原亦是如此，并且标记酶的活性不因标记过程而丧失。整个测定中，抗原与抗体的结合反应在固相支持物上进行，反应结果的判断，以酶与其底物作用后的显色或产生荧光或发光反应为标准，显色或产生荧光或发光的强度，与临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。目前国内的ELISA试剂盒均以酶的显色反应来完成测定。二、固相上抗原抗体相互作用的免疫化学[2,3]通常所提到的抗原与抗体的相互作用，一般指的是在液相状态下，而在固相状态下，抗原与抗体的结合反应有其相应的特点，主要表现在以下四个方面。（一）固相上抗原与抗体结合反应所需要的时间较液相状态下长通常，固相免疫测定如ELISA中，抗原与抗体结合达到平衡所需要的时间，较液相免疫测定要长，并随液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比的增加而增加。当在微孔板孔内进行免疫测定时，界面反应动力学显示其对扩散作用有很强的依赖性，扩散性越强，则反应所需时间越短，结合越充分。这一点可通过旋转振荡来达到，微孔的旋转振荡可促使液体进入到可与抗体或抗原包被的界面接触的较小的区域内。也可在微孔中放一个惰性的塞子以使反应液体成为一个小体积，或使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纤维素，或使用微颗粒来做到这一点。微颗粒小于1μm时，在测定时即成胶体悬液，而当颗粒或珠较大时，则会在没有振荡时，由于重力的作用而分开。所有上述方法均是通过减少液体所占体积与界面抗体或抗原受体所占体积比，从而减少固相免疫测定的扩散依赖性。（二）固相上抗原与抗体接触表面的反应体积远小于液相测定此处的反应体积并非是微孔中的液体体积，而是固相免疫测定中与固相包被的抗体或抗原有接触的部分，这部分体积到底有多少，很难测定，但比反应管中总液体体积要少得多。固相抗原抗体反应发生于液体-固相界面，可能处于一级结合键的引力距离内，小于100Å。液相中待测抗原或抗体要进入到这个结合界面，需要经过扩散或质量转移。微颗粒的反应表面区域较微孔要大得多，因而处于抗原抗体结合界面的体积占总反应体积的比例亦高得多。因此，结合反应的效率更高。这也是全自动化免疫测定分析仪均采用微颗粒固相的重要原因之一。可参与结合反应的抗体或抗原的浓度取决于可参与结合的反应体积，无法精确计算这种反应体积，从而难以使用通常的质量作用定律图形来计算Keq。因此，固相上抗原与抗体反应的Keq值与液相抗原与抗体反应的Keq值没有可比性。（三）固相上抗原和抗体间结合后的离解速率较液相测定低固相免疫测定中固相表面上抗原和抗体间的相互作用，类似于细胞表面上蛋白与其受体间的结合。研究表明，细胞表面上的蛋白与受体结合反应的离解速率较液相中的要低两个梯度，同样，固相免疫测定中，固相上抗原和抗体的离解速率亦同样缓慢，其基本原理相似，概述如下：（1）细胞表面上蛋白与其受体的相互作用涉及到细胞表面受体的聚集，由于多价复合物离解的减少，相应地亲合力增加。研究表明，被动吸附于固相的抗原和抗体也是成簇或聚集状的，因此，反应界面的抗原或抗体可能也是“成簇的”。（2）大多数抗原-抗体的离解所需的能量比防止其结合所需的能量要大，表明在初始结合键形成后，又形成了次级结合键。这提示在固相免疫测定和其它细胞表面反应中，形成了大量的次级结合键。（3）以成簇出现的和来自于限定的界面反应体积内的抗体或抗原，常以很高的浓度存在，这种情况下，即使抗原和抗体有离解发生，离解的抗原的重新结合也较液相系统更为快速。这可以解释为何固相免疫测定与液相测定相比时，其抗体的Keq较高。正是这种极缓慢的离解速率，使得ELISA和固相免疫测定技术具有很好的适用性，即使是测定的反复洗涤步骤，也可使受体配体的相互作用仍保持处于结合状态。（四）微孔内特异抗体免疫测定的亲和力依赖性使用固相包被的复杂抗原进行微孔内特异抗体的免疫测定，与液相测定相比，有明显的亲和力依赖性，固相受体-配体相互作用的稳定性，似乎与微孔内特异抗体的免疫测定亲和力依赖性和极低比例的所捕获的总抗体相矛盾，这可能是因为：（1）在所吸附于固相的复杂抗原中，能与液体中特异抗体结合的抗原浓度极低。这可能是由于所吸附的抗原因为变性或空间位阻而致抗原表位丧失的结果。（2）抗原表位由于固相吸附发生改变，使得特异抗体与其结合的亲和力较低。当抗原以1~5g/ml浓度被动吸附于固相时，大多数蛋白抗原的60-80%至少会以一个单层而稳定的吸附于固相，这样在固相上的总的抗原就不会缺乏。如果500-800ng抗原稳定的吸附于微孔板孔，对含500g/ml抗体的血清的1：10,000稀释可提供大于10倍过量的抗原，考虑到抗原和抗体间相互作用的合理的Keq，只是从吸附抗原的量的有限性，不能解释固相上抗原与抗体结合的低亲和力，而更可能是由于空间位阻或吸附引起的变性所致的抗原表位的丧失所致。（五）固相的抗体或抗原与液相中的抗体或抗原在构型上不一样固相化的抗体或抗原可能与液相中的抗体或抗原所展示的构型不一样，对抗体或抗原由于固相化尤其是被动吸附或其它吸附方式所致的构型改变已有众多的文献报道。本书的另一章节将有专门介绍。三、临床ELISA测定的常用模式ELISA依其测定抗原和抗体的不同，测定模式有很多，如直接法、间接法、双抗体夹心法（直接、间接）、竞争抑制法（直接、夹心等）、捕获法等[4]。在临床实验室，常用的ELISA测定模式有双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、竞争抑制法和捕获法等。在抗原的测定上，蛋白大分子抗原测定用的最多的模式是双抗体夹心法，而对只有单个抗原表位的小分子，则使用竞争抑制法；抗体的测定通常使用间接法、双抗原夹心法、竞争抑制法和捕获法等。（一）抗原测定ELISA模式1.双抗体夹心法对于含多个抗原表位的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的测蛋白抗原的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。具体测定方法如下。（1）首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中2~8℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。（2）加入含待测物的临床样本如血清（浆）等，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体结合而吸附于固相上。（3）加入酶标记的双抗体之二，温育（通常为37℃下）一定时间后，洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。(4)加入酶底物，温育（通常为37℃下）显色测定（图1）。在该测定模式中，有两步温育及板孔洗涤步骤，从而称为“两步法”，如果将上述测定步骤（2）和（3）合并为一步，即将待测样本和酶标抗体在步骤（2）中同时加入，这样就只有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。最初的双体抗夹心测抗原的ELISA试剂盒，均采用“两步法”。后来，为了缩短检测时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HBsAg、甲胎蛋白（α-fetoprotein,αFP）、前列腺特异抗原（PSA）、CA系列标志、hCG及激素等，基本上都采用一步法。一步法相比于两步法，虽然操作简单，但有其固有的缺陷，处理不好，双抗夹心免疫测定结果会因为钩状效应（Hookeffect）的存在而出现假阴性或定量偏低的结果[5-14]。，因此待测抗原浓度的逐步增加，导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，抗原浓度（横坐标）与比色测定得到的吸光度（纵坐标）之间的关系成S形变化曲线（图2）。（2）式在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原（Ag），当其浓度逐步增加时，将使固相抗体（Ab）与抗原的结合逐步达到饱和[（1）式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体（Ab*）后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关Ab•Ag（b复合物）(1)Ab＋AgAb•AgAb•Ag＋Ab*•Ab*（a复合物）(2)而一步法双抗体夹心ELISA的抗原浓度（横坐标）与比色测定得到的吸光度（纵坐标）之间的关系则为钟形曲线（图3）。也就是说测定显色随着待测标本中抗原浓度的增加，在一开始其也是增加的，而当抗原浓度升高至一定程度后，测定吸光度即开始下降，而像一个倒立的鱼钩（图2-3中钟形曲线的实线部分），即所谓的“钩状效应”（其曲线像一个倒立的鱼钩），抗原进一步增加，甚至不出现任何显色（图3中钟形曲线的虚线部分），此时，强阳性标本会测定为阴性，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”（Zonephenomenon）。一步法的反应平衡式如（3）式。Ab•Ag•Ab*＋Ab•Ag＋Ag•Ab*＋Ab*•Ab＋Ag＋Ab*Ag•Ab*(3)abcd其中a为最后测定结果的显色之源，当待测标本中Ag浓度增加时，无疑会使b、c和d复合物增加，从而消耗有限的Ab*，使Ab•Ag•Ab*即a复合物相应减少，显色降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线成钟形，而且由于d复合物的形成，使得在同样的Ab*浓度下，一步法显色较两步法为浅。此外，b和c复合物的增加亦使得“双抗体夹心复合物”难以形成。但如果固相单抗和标记单抗，采用针对抗原的不同且空间距离较远的表位的抗体，即包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗，同时充分混匀反应液，并适当延长反应温育时间，则可使b、c和d复合物减少至最低程度，而大大减轻“钩状效应”。我们曾使用本室能得到的含最高浓度（约2,000,000ng/ml）HBsAg的血清样本，对国内较大的试剂生产厂家的“一步法”HBsAg测定ELISA试剂盒的“钩状效应”进行了评价，尽管大部分试剂在HBsAg最高浓度下的测定显色较次高浓度（1:10稀释）显色要浅，在曲线上出现了“钩状”，但均未出现该份样本测定为阴性的情况。尽管如此，在临床实验室实际工作中，仍有可能遇到“钩状效应”较严重的HBsAg测定ELISA试剂盒，基层实验室同行也有这方面的反映。因此，还应该重视“一步法”试剂盒所致的假阴性问题，当发现测定结果明显与临床不符或与相关测定指标互有矛盾，如HBeAg阳性样本HBsAg测定为阴性时，就应考虑HBsAg测定可能存在的“钩状效应”所致假阴性问题。综上所述，一步法ELISA试剂盒作为迎合临床实验室简便快速要求的产物，有着巨大的市场，其虽有潜在缺陷，易导致含高浓度待测物的标本检测为阴性（假阴性），但精心的实验设计，对包被和酶标记抗体仔细选择，完全可以将“钩状效应”出现的可能性降至最低。此外，建议生产HBsAg、αFP、前列腺特异抗原（PSA）、CA系列标志、hCG及激素等“一步法”免疫测定试剂盒的厂家，应对所产的试剂在出厂前对其“钩状效应”进行充分的研究，并提醒用户在使用时应注意之处。双抗体夹心法测抗原另一个所需要注意的是类风湿因子（RF）和补体等的干扰。我们知道，RF是一种抗变性IgG的自身抗体，主要为19S的IgM类，也可见7S的IgG及IgA。这种自身抗体的特性是其是能多种动物的变性IgG的Fc部份结合。因此，如果血清标本中含有RF，在双抗夹心ELISA检测时，其即可作为固相抗体和酶标抗体（均为IgG）之间的桥接抗原，而产生假阳性反应。同样，抗体也有补体C1q的结合位点，同样会造成类似于RF的测定干扰。2.竞争法大分子抗原因其具有两个以上的抗原表位，而可用双抗体夹心法测定，小分子半抗原如地高辛、茶碱等药物以及T3、T4、睾酮等激素，因其可能只有一个抗原表位，或因为分子太小，结合一个抗体后，因空间位阻，无法再结合另一个抗体，所以不能使用双抗体夹心方法测定，只能采用竞争抑制法。具体步骤如下。（1）先用抗小分子的特异抗体如双抗体夹心法一样包被固相并封闭。（2）同时加入待测样本和酶