微生物发酵-青霉素类抗生素

--青霉素类抗生素一抗生素的概述二青霉素的制备抗生素概述•1.定义•2.作用•3.来源•4.分类•5.作用机制抗生素概述•1.定义：•是某些细菌、放线菌、真菌等微生物的次级代谢产物，或用化学方法合成的相同化合物或结构类似物，在低浓度下对各种病原性微生物或肿瘤细胞有强力杀灭作用或有其他药理作用的药物。返回抗生素概述•2.作用：•抗细菌感染•治疗肿瘤•抗病原虫•免疫抑制剂•刺激植物生长•3.来源：•生物合成（发酵）•化学合成（全合成和半合成）返回抗生素概述•4.分类：青霉素类氨苄青霉素邻氯青霉素RNA合成抑制喹诺酮类利福霉素类核酸合成抑制细胞膜抑制多粘菌素BDNA合成抑制磷霉素头孢菌素类头霉素类大环内酯类麦迪霉素红霉素氯霉素蛋白质合成抑制细胞壁合成抑制四环素类氨基糖苷类返回抗生素概述•5.作用机制：•抑制细菌细胞壁的合成（β-内酰胺类、磷霉素、万古霉素。）•抑制细菌蛋白质合成（四环素、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素类。）•抑制细菌DNA合成（利福平。）•抑制细菌RNA合成（放线菌素。）•损伤细菌细胞膜（两性霉素B、粘菌素、氨基糖苷类。）青霉素的制备一：青霉素的背景二：青霉素的性质三：青霉素的生产工艺过程四：青霉素的应用青霉素的背景•青霉素(Penicillin)又被称为盘尼西林，它是人类发明的第一种抗生素，也是全球销量最大的抗生素。青霉素是一种高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素。它的研制成功大大增强了人类抵抗细菌性感染的能力，带动了抗生素家族的诞生。•1953年，我国第一批青霉素的诞生揭开了我国生产抗生素的历史;到2001年，我国青霉素的产量已经占据了全球的60%的市场份额，目前我国是全球最大的青霉素生产国家。青霉素类抗生素•青霉素的发现•1928年，英国细菌学家Fleming发现污染在培养葡萄球菌的双蝶上的一株霉菌能杀死周围的葡萄球菌。他将此霉菌分离纯化后得到的菌株鉴定为青霉，并将这菌产生的抗生物质命名为青霉素。1940年，英国Florey和Chain进一步研究此菌，并从培养液中制出了干燥的青霉素制品。经实验和临床试验证明，它毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌所引起的许多疾病有卓越疗效。青霉素类抗生素NSOCH3CH3COOHHHHNONSOCH3CH3COOHHHHNOHONSOCH3CH3COOHHHHNOO青霉素G青霉素X青霉素V来源：霉菌属的青霉菌发酵液中提取，天然青霉素有5种G、V、N、K、X、其中PG的活性最高、产量最高。NSOCH3COOHHHHNOH3CNSOCH3COOHHHHNOHONH2O青霉素N青霉素K青霉素理化性质酸性一般的羧酸Pka4-6PGPka2.7OHHNSRCONHCH3CH3COOHH12345672S，5R，6R临床用其钠盐、钾盐或普鲁卡因盐，增强水溶性。粉针剂，有效期2年临床用粉针剂，现用现配不稳定性•β–内酰胺环是青霉素中最不稳定的部分，原因是1、四元环和五元环稠合，环的张力大2、两个环不在同一平面，青霉素结构中β-内酰胺环中羰基和氮原子的孤对电子不能共轭，易受到亲核性或亲电性试剂的进攻，使β-内酰胺环破裂。OHHNSRCONHCH3CH3COOHH12345672S，5R，6Rβ-内酰胺环对水、光、热、酸、碱、酶、醇、胺不稳定，β-环开裂、活性降低或消失对碱或酶(β-内酰胺酶)不稳定，水解NHOSHOOHHNHONHOSHOOHHNHHOOHNHOSOHHNHHONHOCHOCOOHSHNH2PenilloicAcidPenilloaldehyde+PenicillamineOH+orEnzymePenicilloicacidHgCl2OH--CO2对稀酸不稳定，发生重排；PH=4青霉二酸青霉醛青霉胺-CO2NHOSHOOHHNHOH+H+NSOHHNHHOSOHNHOOONPenillicAcidH+pH=4.0HOOCNHOCHOCOOHSHNH2Penilloaldehyde+Penicillamine对羰基亲核反应分解重排对强酸不稳定，发生重排PH=2orHgCl2青霉酸+青霉醛酸△青霉醛NHOSHOOHHNHONHOSOHHNHHONHOCHONHOCHOHOOC-CO2PenilloicAcidPenilloaldehyde+H+orHgCl2PenaldicAcdaβ-环开裂,-CO2abb青霉素生产工艺过程菌种→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取及精制→成品包装菌种介绍：青霉是产生青霉素的重要菌种。广泛分布于空气、土壤和各种物上，常生长在腐烂的柑桔皮上呈青绿色。目前已发现几百种，其中产黄青霉(Penicillumchrysogenum)、点青霉(Penicillumnototum)等都能大量产生青霉素种子制备：种子制备是指孢子接入种子罐后，在罐中繁殖成大量菌丝的过程，其目的是使孢子发芽、繁殖和获得足够数量的菌丝，以便接种到发酵罐当中去。种子制备所使用的培养基及其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。青霉素生产工艺过程发酵条件下的生长过程第1期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。第2期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。第3期：形成脂肪包涵体，机理贮藏物，没有空泡，嗜碱性很强。第4期：脂肪包涵体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。第5期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。第6期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状。释放游离氨，pH上升。第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。1－4期为菌丝生长期，3期的菌体适宜为种子。4－5期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。在第六期到来之前结束发酵。青霉素的发酵•发酵中灭菌•发酵工艺控制：1.基质浓度2.温度3.培养基成分的控制4.pH值、溶氧5.菌丝浓度等6.泡沫的控制发酵中灭菌青霉素属于β-内酰胺类抗生素，其β-内酰胺环极易破坏而失效，所以不可以高压灭菌了，否则将导致完全失效。一般制备青霉素是采用无菌操作法、冷冻干燥技术（真空条件下使冰直接升华，得以除去水分）制备的。发酵工艺控制1.基质浓度：在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制,苯乙酸的生长抑制）,而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成。所以，在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法，以维持一定的最适浓度。发酵工艺控制2.温度：青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别,但一般认为应在25°C左右。温度过高将明显降低发酵产率,同时增加葡萄糖的维持消耗,降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说,最适温度不是一样的,一般前者略高于后者,故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度，以缩短生长时间,到达生产阶段后便适当降低温度,以利于青霉素的合成。发酵工艺控制3.培养基成分的控制:A.碳源--发酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最为便宜，但因货源较少，很多国家采用葡萄糖代替。但当葡萄糖浓度超过一定限度时，会过分加速菌体的呼吸，以至培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，导致pH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长河产物的合成。发酵工艺控制•B.氮源-主要有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米浆为较理想的氮源，含固体量少，有利于通气及氧的传递，因而利用率较高。固体有机氮源原料一般需粉碎至200目以下的细度。有机氮源还可以提供一部分有机磷，供菌体生长。无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量使用。发酵工艺控制•C.无机盐-碳酸钙用来中和发酵过程中产生的杂酸，并控制发酵液的pH值，为菌体提供营养的无机磷源一般采用磷酸二氢钾。另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。由于现在还有一些工厂采用铁罐发酵，在发酵过程中铁离子便逐渐进入发酵液。发酵时间愈长，则铁离子愈多。铁离子在50µg/ml以上便会影响青霉素的合成。采用铁络合剂以抑制铁离子的影响，但实际对青霉素产量并无改进。所以青霉素的发酵罐采用不锈钢制造为宜，其他重金属离子如铜、汞、锌等能催化青霉素的分解反应。发酵工艺控制•D.前体-添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借酰基转移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素G的生产强度，。因此前体的加入成为青霉素发酵的关键问题之一。但苯乙酸对发酵有影响，一般以苯乙酰胺较好。也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其优点是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价格较贵。前体要在发酵开始20h后加入，并在整个发酵过程中控制在50µg/ml左右。前体用量大于0.1%时，青霉素的生物合成均下降。所以一般发酵液中前体浓度以始终维持在0.1%为宜。发酵工艺控制4.pH值、溶氧：青霉素在合理的Ph(6.8～7.2)和溶氧(30%)下，生产和发酵才会达到最高效率！在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧。5.菌丝浓度等：在葡萄糖限制生长的条件下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。而其它的如：菌丝形态等亦会有所影响……发酵工艺控制6.泡沫的控制：在发酵过程中产生大量泡沫,可以用天然油脂,如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂“泡敌”来消泡,应当控制其用量并要少量多次加入,尤其在发酵前期不宜多用,否则会影响菌体的呼吸代谢。加消沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发酵液的pH。发酵液预处理•发酵液中的杂质如高价无机离子（Fe2+、Ca2+、Mg2+）和蛋白质在离子交换的过程中对提炼影响甚大，不利于树脂对抗生素的吸收。如用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在会产生乳化，使溶媒合水相分离困难。对高价离子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸则它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提高发酵滤液的质量。如加磷酸（或磷酸盐），既能降低钙离子浓度，也利于去除镁离子。加黄血盐及硫酸锌，则前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。此外，两者还有协同作用。他们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。•染菌处理染菌是发酵工业长期以来不能彻底解决的问题，因此如何解决染菌问题就成了发酵工业的工作重点之一。要解决染菌问题首要问题就是要能检测出是否染菌。染菌通常通过三个途径发现：无菌试验，发酵液直接镜检，发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要依据。染菌的常用检测法•无菌试验的方法有双碟培养斜面培养肉汤培养镜检等，其中以双碟培养为主。无菌试验的方法--双碟培养双碟培养的操作要点是：种子罐在培养过程中每8小时取样一次，取样时在装有9毫升肉汤的试管内加入2～5毫升试样，然后在无菌室内通过无菌操作在事先铺好琼脂培养基的双碟内画线。剩下的肉汤培养物，在37℃培养6小时后复画一次，及另画一双碟作比较，发酵罐在发酵过程中每隔8小时取样一次，用空白试管取样5～15毫升左右，于37℃培养6小时后画碟时，双碟放置37℃培养．24小时内的双碟，每隔2～3小时在灯光下检查一次，观察有无杂菌生长。24～48小时的双碟每天检查一次，以防生长缓慢的杂菌漏检。一般杂菌在37℃，24小时以内能长出来．此法的优点是比较准确，但反应较慢（因杂菌在双碟上繁殖成菌落要有一定的时间），并且操作也较麻烦。无菌试验的方法--斜面/肉汤培养斜面或肉汤培养法，就是直接用酚红肉汤取样培养，或直接用斜面取样培养，但也有先用空白无菌试管取样，再接种于肉汤或斜面培养基的。也有在中小罐接种前，无菌试验样品先进行镜检。直接取样进行无菌试验的方法比较方便。无菌试验的结果，一般要8～16小时才能做出判断。为了加速杂菌的生长，特别是对中小罐无菌情况的及时判断，可以加入对氨基苯甲酸等生长促进剂，以促进杂菌的生长。染菌的处理•染菌后一般是丝状菌丝对过滤有影响，以及发酵杂菌产物对提取有影响。因此应对污染过的发酵液作加热预处理，加助滤剂等有利于过滤，对发酵产物中的杂质如蛋