微生物发酵产酶(五、一)

第六节微生物发酵产酶武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)微生物发酵产酶目前工业用酶大多数来自微生物。经过预先设计，通过人工操作，利用微生物细胞的生命活动获得所需酶的技术过程称为酶的发酵生产。酶的发酵生产是现在产酶的主要方法。一、酶发酵生产的类型1、固体培养发酵：主要适于各种霉菌的发酵产酶培养基以麸皮、米糠等为主要原料，经灭菌后，接入产酶菌株，在一定条件下发酵。例:麸皮、米糠酒曲、酱油曲淀粉酶、蛋白酶优点：设备简单，操作方便，酶浓度高。缺点：劳动强度大，原料利用率低，生产周期长。2、液体深层发酵（目前酶发酵生产的主要方式）液体培养基，经灭菌、冷却后，接入产酶细胞，在一定条件下发酵。适于微生物、动植物细胞。优点：机械化强度高，酶产率高，产品回收率高缺点：技术管理要求高3、固定化细胞发酵（70年代后期发展）将细胞固定在载体上后，进行发酵生产。优点：细胞密度高，可反复使用，利于产品分离纯化缺点：需要特殊的固定化细胞反应器，只适用胞外酶生产4、固定化原生质体发酵（80年代中期发展）原生质体是指除去了细胞壁的微生物细胞或植物细胞。优点：解除细胞壁扩散阻碍；易于细胞间质中的酶的分泌；可反复或连续使用缺点：制备复杂，维持较高的渗透压，需防止细胞壁再生1、酶合成的诱导作用在培养基中加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为诱导作用。诱导剂一般是酶催化作用的底物或其底物类似物。例：乳糖诱导ß-半乳糖苷酶的合成淀粉诱导a-淀粉酶的合成蔗糖和纤维素是蔗糖酶和纤维素酶的诱导剂二、酶生物合成的调节2、酶合成的阻遏产物、分解代谢产物阻遏是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。葡萄糖阻遏ß-半乳糖苷酶的生物合成果糖阻遏a-淀粉酶的生物合成三、酶生物合成的模式微生物细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历延滞期、生长期、稳定期和衰亡期等4个阶段延滞期对数生长期稳定期衰亡期时间细胞数量的对数（一）微生物生长曲线（Microbialgrowthcurve）（二）酶生物合成的模式（1）同步合成型（2）延续合成型（3）中期合成型（4）滞后合成型通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶的生物合成的模式分为4种类型：1、同步合成型酶的生物合成与细胞的生长同步进行，又称生长偶联型。大部分组成酶和部分诱导酶的生物合成属于同步合成型。特点：（1）发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。（2）生长至平衡期后，酶浓度不再增长时间(h)浓度细胞浓度酶浓度2、中期合成型酶的合成在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入稳定期后，酶的合成也停止。特点：（1）该类酶的合成受分解代谢物阻遏。浓度酶浓度细胞浓度时间(h)3、延续合成型酶的合成伴随着细胞生长而开始，但在细胞进入稳定期后，酶还可以延续合成较长的一段时间。特点：（1）该类酶不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。时间(h)浓度细胞浓度酶浓度4、滞后合成型只有当细胞生长一段时间或者进入稳定期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：（1）该类酶受分解代谢物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。时间(h)浓度酶浓度细胞浓度属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入稳定期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。小结：影响酶生物合成模式的主要因素：培养基中阻遏物的存在和mRNA的稳定性。（1）不受培养基中某种物质阻遏时，可随着细胞生长而开始合成；受阻遏的酶，要在细胞生长一段时间或进入稳定期后，解除阻遏，酶才开始合成。（2）mRNA稳定性高的，可在细胞停止生长后继续合成其对应的酶；稳定性差的，随着细胞生长停止而终止酶的合成。（3）在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。第二节产酶微生物的特点用于酶发酵生产的微生物必需具备的条件：（1）酶的产量高（2）容易培养和管理（3）产酶稳定性好（4）利于酶的分离纯化（5）安全可靠（一）常用的产酶微生物1、细菌大肠杆菌（Escherichiacoli）形态：杆状，革兰氏阴性，运动或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶。常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。醋酸杆菌（Acetobacter）菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，不生芽孢。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆)枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、核苷酸酶。2、放线菌(Actinomycetes)放线菌是一类具有分支状菌丝的单细胞原核微生物,由于菌落呈放射状而得。放线菌菌落中的菌丝常从一个中心向四周辐射状生长,因此叫放线菌。放线菌产酶举例链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。3、霉菌（molds）霉菌:是一类丝状真菌。构成霉菌菌体的基本单位称为菌丝（hyphae），呈长管状，可不断自前端生长并分支。大量菌丝交织成绒毛状、絮状或网状等，称为菌丝体（mycelium）。菌丝体常呈白色、褐色、灰色。霉菌繁殖迅速，常造成食品、用具大量霉腐变质，但许多有益种类已被广泛应用，是人类实践活动中最早利用和认识的一类微生物。选用不同的霉菌作为发酵菌种，不仅可以酿制酱、酱油、醋、豆腐乳等食品，还可以应用于生产有机酸、酶制剂、维生素、生物碱及激素等多种产品;据统计，在550种酶制剂中有近1/3是霉菌产生的。霉菌与产酶霉菌产酶举例生产糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、过氧化氢酶、脂肪酶等；黑曲霉（Aspergillusniger）米曲霉（Aspergillusoryzae）生产糖化酶、蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。红曲霉（Monascus）生产α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。青霉是世界分布最广的几类真菌之一。生产葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶等。青霉（Penicillium）木霉（Trichoderma）木霉具有较强分解纤维素能力。在木质素、纤维素丰富的基质上生长快，传播蔓延迅速。棉籽壳、木屑、段木都是其良好的营养物。生产纤维素酶的重要菌株。根霉(Rhizopus)根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。应用：根霉能产生糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶等。4、酵母啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等。假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊酸酶、转化酶、醇脱氢酶等。第二节发酵产酶工艺条件及其控制发酵法生产酶制剂，就是给酶的生产菌种提供适当的营养和生长环境，使生产菌大量增殖，同时合成所需要的酶，然后由发酵所得物料制成酶产品。现代酶制剂的大规模生产以液体深层发酵法为主。无论哪种发酵法，都要做三方面的工作：（1）从原料准备培养基；（2）从原始菌种准备生产菌种；（3）发酵过程管理。发酵产酶的一般工艺流程[原料][原始菌种][麸皮等原料]↓↓饼粕等原料淀粉质原料试管斜面培养(活化)[配制培养基]↓↓↓(灭菌)按不同原料净化、粉碎摇瓶等分级扩大培养作不同处理↓↓水解种子罐培养↓↓[淀粉糖液][发酵罐(液体发酵)][发酵池(固体发酵)]↓↓↓培养配制培养基↓(灭菌)[发酵液][成品曲]↓↓↓下游加工{液态酶制剂}↓{固体粗酶制剂}{各种精制酶制剂}酶发酵生产的一般工艺流程图一、生产种子的制备生产种子：由原始保藏菌种，经过活化，扩大培养，用于发酵罐接种的大量菌体。1、种子制备工艺过程保藏菌种活化培养逐级摇瓶培养种子罐培养接种至发酵罐二、培养基1、碳源：提供碳元素；能源。碳源、氮源、无机盐、生长因素、水等。来源：淀粉及其水解物—淀粉水解糖、糖蜜、或含淀粉的原料如大米、薯类、玉米、麸皮、米糠等。此外有些微生物可以采用脂肪、石油、乙醇等为碳源。注意：在选择碳源时，应尽量选择对所需酶有诱导作用的碳源，而不使用或少使用有分解代谢物阻遏作用的碳源。培养基是人工配制的供微生物生长、繁殖及合成酶的营养物质的混合物。2、氮源：提供氮元素。来源：①有机氮：常利用农副产品的籽实榨油后的副产品，如豆饼、花生饼、菜子饼等；②无机氮：含氮的无机化合物，如（NH4）2SO4、NH4NO3、NaNO3和（NH4）3PO4等。3、无机盐：大量元素和微量元素。基本功能：构成细胞的成分；构成酶产品的组分；作为酶的激活剂。4、生长因子指微生物生长繁殖所必不可缺的微量有机物，主要包括各种氨基酸、嘌呤或嘧啶、维生素等三类物质。酶制剂中所用的生长因子，大多是由天然原料提供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、麸皮、米糠、酵母膏等。5、水微生物发酵产酶培养基举例1、枯草杆菌BF7658ａ-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%豆饼粉4%磷酸氢二钠0.8%硫酸铵0.4%氯化钙0.2%氯化铵0.15%自然pH三、发酵条件的控制1、温度的调节控制（2）有些微生物生长最适温度与发酵产酶的最适温度有所不同。例：酱油曲霉生产蛋白酶，28℃时蛋白酶产量比在40℃条件下高2~4倍，在20℃条件下发酵，则蛋白酶产量更高，但细胞生长速率较慢。为此，在有些酶的发酵生产过程中，要在不同的发酵阶段控制不同的温度，即在微生物生长阶段控制在生长的最适温度范围，而在产酶阶段控制在产酶最适温度范围。（1）不同的微生物有不同的最适生长温度。（3）温度的控制方法一般采用热水升温，冷水降温。因此，在发酵罐中均设有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管，夹套、喷淋管等。2、pH值的调节控制（1）不同微生物，其生长繁殖的最适pH值有所不同。（2）微生物生长的最适pH值与产酶最适pH值往往不同。（3）有些微生物可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。黑曲霉α-淀粉酶糖化酶pH值中性↑↓pH值偏酸性↓↑（4）影响pH值的因素①一般来说，培养基成分中C/N比高，发酵液倾向于酸性，pH低；C/N比低，发酵液倾向于碱性，pH高。①不同盐的利用对pH也会产生影响。（5）生产中控制pH值的方法②添加缓冲液维持一定的pH值（如磷酸盐）；①调节培养基的原始pH，保持一定的C/N比；③发酵液中pH过高，加糖或淀粉来调节。反之，加尿素或液氨；①pH值还与通气量有关。④通过调节通气量来实现；⑤加酸、碱。3、溶解氧的调节控制溶解氧指溶解在培养基中的氧。微生物一般只能利用溶解氧。调节溶氧速率的方法（1）调节通气量；（2）调节氧的分压；（3）调节气液接触时间；（4）调节气液接触面积；（5）改变培养液性质。5、湿度的调节控制用固体培养基生产酶制剂时，一般前期湿度低些，培养后期湿度大些，有利于产酶。4、泡沫形成：通气搅拌、培养基中某些成分的变化、代谢产生的气体。危害：阻碍CO2的排除，影响氧的溶解；引起染菌。消泡方法：机械消泡、化学消泡。四、提高酶产量的措施（一）添加诱导物诱导酶的发酵生产，添加酶合成的诱导物，可以显著提高酶产量。诱导物的浓度：必须控制在适当浓度。（二）控制阻遏物的浓度1、解除终产物阻遏的方法降低培养基中酶作用产物的浓度；添加终产物的类似物。2、解除分解代谢产物阻遏的方法生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等酶时，控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源浓度，可采用其他较难利用的碳源（如淀粉等），采用分批补料、流加碳源等方法，以控制碳源浓度在较低的水平，利于酶产量的提高；三、添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞