F外周血单个核细胞的研究中国实用儿科

EB病毒感染外周血单个核细胞的研究李金颖1付丽娟2邸顺祥1宋晓燕1朱庆玲1基金项目：哈尔滨市科学技术局青年科学研究基金（2005AFQQJ044）作者单位：1.哈尔滨市儿童医院感染科，黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江省医院感染内科，黑龙江哈尔滨150036E-mail:[e-mail][摘要]目的：应用荧光定量PCR方法检测EB病毒（EBV）感染患儿外周血单个核细胞（PBMC）中的EBVDNA，探讨EBV感染单个核细胞的临床意义。方法：应用酶链免疫吸附方法（ELISA）和荧光定量PCR方法同步平行检测38名EBV感染患儿发热7天内、起病一个月、三个月、六个月及九个月血浆中EBVVCR-IgM、外周血全血、血浆、单个核细胞（PBMC）中EBVDNA，比较四种检出方式的检出率在EBV感染患儿病程中的变化。结果：在EBV感染初期，全血和单个核细胞中EBVDNA阳性率最高，与EBVVCR-IgM及血浆EBVDNA相比，具有统计学意义（P0.05）；起病后的一个月、三个月、六个月及九个月，四种检出方式的阳性率均逐渐减低，但单个核细胞中EBVDNA敏感性始终高于其他三种方式，具有统计学意义（P0.05）。结论：EBV感染初期，用全血和单个核细胞检测EBVDNA，是早期、快速、敏感的检测方法；EBV可长期存在于单个核细胞中，EBV感染患儿表现出多系统损伤可能与PBMC中EBV感染相关；荧光定量PCR方法检测外周血单个核细胞EBVDNA对EBV感染的诊断有极高价值，可作为判断疗效及监测病情的一种有效手段。[关键词]EB病毒DNA；单个核细胞（PBMC）；全血；血浆；荧光定量PCRStudyonEpstein-Barrvirusinfectedinperipheralbloodmononuclearcells.LjJin-ying1，FuLi-juan2，DiShun-xiang1，etal.1、DepartmentofInfectiousDiseases,Children′shospitalofHarbin,2、DepartmentofInfectiousDiseasesHeiLongJiangprovincehospital150036.Abstractobjective：TodetectEBVDNAinperipheralbloodmononuclearcells(PBMC)ofEBVinfectedchildrenbyfluorescencequantitativePCR，andinvestigatetheclinicalsignificanceofEBVinfectedinmononuclearcells.Method:usingELIASandfluorescencequantitativePCRtosynchronouslydetectEBVVCR-IgMinplasma,EBVDNAinperipheralwholeblood,plasmaandPBMCof38EBVinfectedchildrenwithinsevendayswithfever,one、three、sixandninemonthsfromonset,andcomparethedetectratechangeofthefourdetectionmethodsinthecourseofdiseaseofEBVinfection.Result:IntheearlydaysofEBVinfection,thehighestpositiveratesareEBVDNAinwholebloodandPBMCandthereisstatisticalsignificancecomparedwithEBVVCR-IgMandEBVDNAinplasma（P0.05）.Inone,three,sixandninemonthsfromonset,thepositiverates2decreasegraduallyinthefourdetectionmethods,butthesensitivityofEBVDNAinPBMCishigherthantheothermethods,andwithstatisticalsignificance（P0.05）.Conclusion:intheearlydaysofEBVinfection,thedetectionofEBVDNAinwholebloodandPBMCisanearly,rapidandsensitivemethod.EBVmayexistinmononuclearcellsforalongtime,themulti-systeminjuryofEBVinfectedchildrenmayberelatedtoEBVinfectioninPBMC.UsingFluorescencequantitativePCRtodetectEBVDNAinPBMCisofhighvalueinthediagnosisofEBVinfection.Itcanbeusedasaeffectivetoolinjudgingeffectanddetectingpatient'scondition。Keywords:EBVDNA;PBMC;wholeblood;plasma;FluorescencequantitativePCREB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)是小儿感染性疾病常见的病原体，感染时症状轻重不一，典型者表现为传染性单核细胞增多症（InfectiousMononucleosis，IM）。EB病毒感染还可以累及全身多个系统，,易引起组织细胞增生症、恶性网状细胞增生症、嗜血细胞综合征等较严重的疾病。有时不能早期诊断，且极易误诊。我科于2005年5月至2007年12月收治的38例EBV感染患儿，就其诊断问题进行研究。1资料与方法1.1对象选取2005年5月至2007年12月，我科收治38例住院患儿，符合EB病毒感染诊断标准[1]，其中男20例，女18例，年龄6月至1.5岁，平均年龄1.2岁。入院时均为初诊病例，入院前未经治疗。临床表现均发热3天至7天，有免疫缺陷或抑制的病人不在研究范围内。1.2研究方法（1）血清EBVVCA-IgM检测,采用ELISA，按试剂盒操作说明进行。（2）血液EBVDNA提取，抽取每个研究对象外周血4ml加入EDTA抗凝管中，1600×g离心后分离上层血浆，用淋巴细胞分离液从全血中分离出单个核细胞，置于-20℃保存。每例患者取50uL血浆、单个核细胞及全血，用全血基因组提取试剂盒及外周血单个核细胞DNA提取试剂盒抽提DNA，操作方法按试剂盒说明书进行。抽提出的DNA在紫外分光光度计上测260nm及280nm处吸光度，比值（A260∕A280）约在1.8左右。（3）荧光定量PCR法EBV基因扩增试剂盒由中山大学达安基因诊断中心提供，应用PTC-100TM型PCR仪检测全血、血浆、PBMCEB病毒DNA含量。检测方法按说明书进行。1.3统计学处理采用SPSS13.0软件,计数资料采用χ2检验,计量资料采用t检验，P0.05,差异有显著性意义。2结果2.138名EBV感染患儿比较入院时及随诊3月、6月、9月外周血EBV感染情况，检查结果如下，见表Ⅰ。3表Ⅰ38名EBV感染患儿外周血EBV感染结果IgM血浆全血PBMC阳性率阳性率平均DNA数阳性率平均DNA数阳性率平均DNA数入院时26%（10/38）50%（19/38）4013.0582%(31/38)5340.7489%(34/38)8859.501个月后24%（9/38）5%（2/38）432.5021%（8/38）1043.0026%（10/38）1239.303个月后11%（4/38）0%0011%（4/38）608.7516%（6/38）694.676个月后0%00%000%0011%（4/38）552.259个月后0%00%000%008%（3/38）516.002.2EBV感染初期即入院时EBVDNA结果对比，见表Ⅱ。表Ⅱ：Spss入院时检验结果比较NPCR+(%)平均NDA方差Std.ErrorMeanPBMC3489%8859.5024660.6454229.266全血3182%5340.744755.500854.113血浆1950%4013.052934.012673.109经统计学处理，外周血血浆、全血、PBMC中EBVDNA阳性率大于EBVVCR-IgM，具有统计学意义（P0.05）；全血、PBMC中EBVDNA阳性率大于血浆，具有统计学意义（P0.05）；全血及PBMC中EBVDNA阳性率基本一致，无统计学意义（P0.05），但全血中EBVDNA平均拷贝数低于PBMC。2.3一个月后，检测38名EBV感染患儿EBVDNA结果对比，见表Ⅲ。表Ⅲ：Spss一个月后检验结果比较NPCR+(%)平均NDA方差Std.ErrorMeanPBMC1026%1239.30636.664201.331全血821%1043.00527.719186.577血浆25%432.50270.822191.50042.4三个月后，检测38名EBV感染患儿EBVDNA结果对比，见表Ⅳ。表Ⅳ：Spss三个月后检验结果比较NPCR+(%)平均NDA方差Std.ErrorMeanPBMC616%694.67305.401124.680全血411%608.75113.41256.706血浆0－－－3讨论EB病毒(EBV)是一种DNA病毒,属疱疹病毒科,广泛存在于自然界,是一种普遍感染人类的病毒,具有潜伏及转化的特性[2]。EBV感染是小儿长期发热的病因之一,感染后多数表现为传染性单核细胞增多症,部分患儿因病情得不到控制,感染可迁延不愈或继发其它恶性疾病[3]。自1964年Epstein及Barr等从非洲儿童恶性淋巴瘤的细胞培养中首次发现EBV以来,不断发现EBV与许多疾病,特别是越来越多的恶性肿瘤相关。因此，早期诊断及长期随访至关重要。3.1EBV感染早期，用外周血全血和单个核细胞检测EBVDNA，是早期、快速、敏感的检测方法长期以来，ELISA法一直是临床诊断及检测EBV感染的传统方法，其检测的是人体对病毒的免疫状态，小儿体液免疫功能尚未发育完善，还处于相对低水平，所以抗EBV抗体测定阳性率偏低[4]。本研究中，EBV感染7天以内，EBVVCR-IgM阳性率仅为26%，远远低于外周血EBVDNA检测；EBVVCR-IgM出现在疾病的急性期1-2周内，持续约1-3月。因此，在疾病早期第一周内，检出率较低，即便EBVVCR-IgM阴性，也不能除外传单，需要复检。本研究中，EBV感染一个月后，大部分EBV感染控制的情况下，VCR-IgM阳性率仍可达24%，也说明了VCR-IgM抗体形成较晚，且不易消失，可持续1-3月。ELISA法无法检测病毒自身，也就无法更准确、灵敏地反映EBV感染的情况。VCR-IgM仅在EBV首次感染急性期可见滴度明显升高，恢复期和健康携带者抗体滴度稳定在低水平，再次感染、复发或免疫抑制患者往往不表现此抗体的升高，易出现假阴性反应。另外，有文献报道[5]，当病人为微小病毒、巨细胞病毒、、钩端螺旋体、弓形虫等感染时，VCR-IgM易出现假阳性反应；VCR-IgM还容易受到类风湿因子的干扰而出现假阳性结果。如果检测EBVVCR-IgM的结果为阳性，必须排除以上因素，方可做出EBV急性或近期感染的诊断。而PCR方法则是检测病毒核酸，更能准确灵敏地反映EBV感染和病毒复制情况。实时荧光定量PCR技术，其扩增和产物检测一步完成，整个检测过程全封闭进行，无需打开扩增管，避免了产物污染，并经证明，方法操作简便，重复性高，易标准化[6]。实时荧光定量PCR能够准确地检测病毒的拷贝数，为EBV患者在临床诊断及治疗上提供很大帮助。本研究显示，PBMC和全血中的EBV检出率显著高于血浆，具