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GST-pulldown实验一、实验所需试剂及配制:1、LB培养基成分:1%(W/V)Tryptone5%(W/V)YeastExtract1%(W/V)NaCl步骤:(1)称取下列试剂,置于1L烧杯中:Tryptone10g;YeastExtract5g;NaCl10g(2)加入约800ml去离子水,充分搅拌溶解(3)滴加NaOH调节PH值至7.0-7.2(注:1L培养基约需5MNaOH1ml)(4)加去离子水定容至1L(5)高温高压灭菌后,4℃保存。2、LB/Amp培养基配制成分:1%(W/V)Tryptone5%(W/V)YeastExtract1%(W/V)NaCl0.1mg/mlAmp(氨苄青霉素)步骤:(1)--(5)同上(6)高压后,温度降至60℃以下,加入1LAmp(100mg/ml)后均匀混合,4℃保存。(注:高压后直接加入,温度过高易使抗生素灭活)3、Amp(100mg/ml)配制:步骤:(1)称量5gAmp置于50ml离心管中(2)加入40ml灭菌水,充分混合溶解后,定容至50ml(3)用0.22um过滤膜过滤除菌(4)小分分装(1ml/分)后,-20℃保存。4、LB固体培养基配制:成分:1%(W/V)Tryptone5%(W/V)YeastExtract1%(W/V)NaCl15g/L琼脂糖粉步骤:(1)同LB培养基称取上述试剂充分混匀后并调PH值(2)高压灭菌后,等待培养基冷却至50-60℃,加入抗生素,摇匀(3)超净台中均匀铺板,待冷却凝固后,4℃密封保存(注:每个板子大约需要25ml培养基)二、目的质粒转化大肠杆菌、菌种挑取及保存(一)转化1、-80℃冰箱中取感受态细菌(15ul),冰上解冰。2、加入质粒DNA溶液(5ul),轻摇匀,冰上放置30min。3、42℃水浴中热击45s,促使细菌吸收质粒,热击后迅速置于冰浴冷却2min。4、将其转移到预先加入600-800ulLB液体培养基(不含抗性)的离心管中,混匀后,37℃震荡培养1h(使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因)。5、吹匀菌体,涂布于含抗性的固体筛选培养皿上,于37℃温箱正面向上放置30min,待菌液完全吸收后倒置培养皿,继续培养12-16h。(二)挑菌、保存1、挑菌:在LB固体培养基中挑出单个菌落(不能成簇生长),用10ul枪头或者牙签挑取菌落,菌落吹散装入含有LB培养基(4-5ml,含Amp)的离心管中,于37℃摇床150rpm摇菌7-8h。其余可保鲜膜密封保存于4℃。(注:摇菌时摇菌管瓶盖应松口,并用胶带适当固定防脱落)2、摇菌生长7-8h后,细菌多处于生长期,可进行细菌大量扩增,也可在此状态保存菌种。菌液保存条件:甘油:菌液=2:8,-80℃保存(注:一般每次保存1ml)三、细菌扩增、GST融合蛋白制备1、小摇:分别取含有PGEX-PAK、PGEX-2T质粒的E.coliBL-215ul,加入5mlLB/Amp培养基中,37℃,150rpm,6-8h,小摇复苏。2、大摇:取适量的小摇复苏的菌液,按菌液与LB/Amp培养基1:1000的比例,37℃,100rpm,过夜培养3、诱导:各瓶加入适量IPTG诱导蛋白表达(注:1M的IPTG1:2000使用,24g/ml的IPTG1:500使用),28℃,130rpm,继续培养3h(注:一般大摇和诱导表达的总时间不应超过12-14h)4、离心:诱导后的菌液收集于50ml离心管中,4℃,2800rpm,离心30min,弃上清。采用3ml/50ml细菌裂解液(1*PBS,1%TritonX-100)重悬菌体沉淀,每管1ml分装。(注:根据细菌生长情况,也可以1ml/0.1g湿菌)5、碎菌:超声裂解细菌(3*10秒/管),4℃静置10min,后13000rpm离心10min转移上清至1.5ml离心管中。6、Beads(结合):各管加入40ul谷胱甘肽亲和纯化球珠(glutathione-Sepharose4Bbeads),4℃孵育过夜7、将过夜的Beads4℃,7500rpm,5min离心;小心弃去上清;8、用1mlPBS液重悬沉淀;7500rpm,4℃离心5min;小心弃去上清;重复此步操作4次.9、各管的Beads加入70ul1*LoadingBuffer,电泳考马斯亮兰染色观察融合蛋白的表达水平。其余各管离心后取沉淀,准备与细胞理解液孵育。四:裂解肺炎衣原体感染的平滑肌细胞衣原体感染后的平滑肌细胞,加入300-400ul的细胞裂解液,冰上裂解后收集,13000rpm,4℃,10min离心,取上清,并测定蛋白浓度。五:GST融合蛋白与细胞裂解液孵育1、取一管Beads并离心后的沉淀,根据测定的蛋白浓度,加入约1.0mg相应体积的蛋白裂解液,4℃孵育4-6h。2、孵育后的珠子4℃,1000rpm,5min离心,小心弃上清,用1mlPBS重悬沉淀,重复4次。离心四次后,小心吸干净上清,加入70ul1*Loadingbuffer,100℃,煮沸10min,冰上放置5min,重复一次,使珠子、GST融合蛋白、Rac1-GTP充分分离3、制胶、上样Westernblot实验检测Rac1活性(注:Rac1分子量小,选择使用12%分离胶)
本文标题:GST-pulldown
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