HBV感染的核酸诊断

1HBV感染的核酸诊断1.HBVDNA检测：HBVDNA检测对临床诊治和血液安全筛查等有重要意义。基于实时荧光定量PCR技术发展起来的HBVDNA定量检测是目前乙型肝炎抗病毒治疗疗效评价的重要指标。HBVDNA监测是HBV反病毒治疗路线策略制定的关键依据：Keeffe等将21周抗病毒治疗的HBVDNA分为60、60～2000、2000U/ml3个水平段，分别代表早期疗效预测的完全应答、部分应答和不应答。而且，基线HBVDNA水平与抗病毒应答、组织学改变以及耐药性等相关。作为疗效监测指标，要求HBVDNA测定有很高的稳定性和灵敏度。目前一流HBVDNA宣检测试剂的定量范围在（1*101～1*109）U/ml之间，对于低拷贝（102拷贝/ml以下）HBVDNA在抗病毒治疗中获得持续应答的检测十分重要。对隐匿性HBV感染（OBI）的诊断主要依赖于高灵敏度的HBVDNA检测。OBI是指血清中HBsAg检测阴性，而肝组织/血清HBVDNA检测阳性的不典型HBV感染。在肝细胞癌患者、HCV感染者和anti-HBc单独阳性的人群中均有一定比例的OBI。由于病毒分泌、复制障碍而形成的隐匿性HBV感染，其血清病毒载量常常较低（低于1000U/ml）。美国FDA要求用于血液筛查的核酸检测试剂须对50拷贝/ml（约10U/ml）含量的标本检出率大于95%。HBVDNA测定灵敏度亟待提高，李金明等调查报告显示弱阳性质控血清HBVDNA含量低于5*105拷贝/ml时大部分实验室（56%）测不出。国内已有机构研发低拷贝的HBVDNA检测技术，仍待评价和推广。22.HBV基因的检测：依据全基因组异质性8%的标准，目前全球流行的HBV共分为A～H8个基因型。不同基因型的HBV感染，在抗原表达水平、核酸复制水平、干扰素应答水平和疾病预后上存在显著不同。就我国目前已经贩A、B、C、D、4种基因型来说，基因型B和C的HBeAg表达水平和病毒复制能力高于基因型A和D；而基因型A和B的患者对于干扰素治疗的应答要优于基因型C和D，其进一步发展为肝硬化或肝癌的风险也小于基因型C和D。基于全基因序列测定的分子进化树基因分型方法是HBV基因分型的“金标准”，除能准确确定毒株基因型、亚型外还能发现其他方法很难鉴别的重组毒株。但其操作复杂，技术要求高且价格昂贵，很难在临床实验室全面推广。目前临床一般采用部分序列测定法（一般扩增病毒S基因，对PCR产物进行直接序列测定分型）和限制性片段长度多态性分析等方法进行HBV分型。新近投入应用或正在发展中方法包括：多引物实时荧光定量PCR溶解曲线分析、PCR、与杂交检测相结合的线性探针技术(INNO-LiPA)等。3.HBV重要基因变异的检测：核苷类似物耐药变异、核心启动子变异(BCP,A1762T/G1764A)、前CHBeAg终止变异和HBsAg基因关键氨基酸变异等HBV基因组变异的检测对乙型肝炎临床诊断、抗病毒治疗方案的选择和预后判断等有积极意义。拉米夫定（LAM）等核苷类似物主要耐药变异常发生于DNA聚合酶C区YMDD结构域，该部位正是LAM抑制HBV复制的关键。YMDD中rt204Met(M)可被Wal(V)或ILe(I)取代，变异成YVDD或YIDD，导致该亚结构域的空3间构型改变，从而妨碍了与LAM的结合。YIDD变异可单独存在，而YVDD则常伴有聚合酶B区rt180位的亮氨酸（L）由蛋氨酸（M）取代的变异。此种变异的HBV对LAM的敏感性显著下降。阿德福韦(无环磷酸酯类)耐药变异点主要集中于P基因D区rt236T位点和（或）B区rtA181V/T，此外，新型的核苷类抗HBV药物恩替卡韦、替诺福韦等也存在相应的耐药位点。在抗病毒治疗中发生HbsAg阴转而HBVDNA载量并未随之下降时，常需考虑BCP双突变和PreC变异发生的可能性，而对隐匿性乙型肝炎患者进行S区氨基酸变异检测可确定其HbsAg检测阴性的原因。对于这些关键变异的检测，目前所采用的方法与HBV基因型检测方法基本类似。最近，Innogentics基于线性探针杂交技术建立的INNO-LiPAHBVDRv2/DRv3可辨别单独或同时存在的多个耐药突变，可检测到5%的变异亚种，灵敏度达100U/ml左右。